ELISA基礎(chǔ)知識(shí)和注意事項(xiàng)

1、2/20/2022整理ppt1 ELISA基礎(chǔ)知識(shí)和注意事項(xiàng)基礎(chǔ)知識(shí)和注意事項(xiàng)2/20/2022整理ppt2 類容類容oELISA的基本原理和相關(guān)概念o特別說說捕獲法oELISA結(jié)果的影響因素oELISA結(jié)果的處理2/20/2022整理ppt3ELISA的基本原理和相關(guān)概念 2/20/2022整理ppt42/20/2022整理ppt52/20/2022整理ppt6ELISA的分類o測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙抗體夾心法。 o測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法2/20/2022整理ppt7競爭法elisao 競爭法2/20/2022整理ppt8 包被特異性抗體包被特異性抗體 酶標(biāo)抗原酶

2、標(biāo)抗原檢測抗原檢測抗原孵育孵育洗滌后顯色洗滌后顯色加樣加樣AB競爭法競爭法ELISAELISA3.顯色顯色3.孵育孵育1.加樣加樣2/20/2022整理ppt9 雙抗體夾心法o檢測測抗原要有至少具有2個(gè)抗原決定簇2/20/2022整理ppt10包被特異性抗體包被特異性抗體雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISAELISA檢測抗原檢測抗原1.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.顯色顯色酶標(biāo)特異性抗體酶標(biāo)特異性抗體2/20/2022整理ppt11雙抗原夾心法2/20/2022整理ppt123.洗滌洗滌1.加樣加樣2.孵育孵育6.顯色顯色5.孵育孵育4.加入酶標(biāo)加入酶標(biāo)抗原

3、抗原雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA2/20/2022整理ppt13間接法 o酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子o只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二抗只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二抗檢測各種與抗原結(jié)合的抗體檢測各種與抗原結(jié)合的抗體2/20/2022整理ppt141.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.顯色顯色間接法間接法ELISA2/20/2022整理ppt15捕獲法2/20/2022整理ppt161.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入抗原加入抗原孵育孵育5.加入二抗加入二抗孵育孵育6.顯色顯色捕獲法捕獲法ELISA

4、2/20/2022整理ppt17 區(qū)別理解o 檢測抗原？抗體？o 包被什么？ 標(biāo)記什么？ 2/20/2022整理ppt18間接法和捕獲法比較o 間接法：假陰性，假陽性o捕獲法：酶標(biāo)抗體的要求較高2/20/2022整理ppt19間接法的假陽性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM抗人抗人酶標(biāo)IgM抗體類風(fēng)濕因子陽陽性性結(jié)結(jié)果果假假陽陽性性結(jié)結(jié)果果2/20/2022整理ppt20間接法的假陰性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM酶標(biāo)抗人IgM抗體陽陽性性結(jié)結(jié)果果假假陰陰性性結(jié)結(jié)果果2/20/2022整理ppt21ELISA的有關(guān)名詞概念o質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可

5、以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對(duì)照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評(píng)價(jià)方法。用于室用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值值2-3倍的倍的質(zhì)控品。質(zhì)控品。2/20/2022整理ppt22o室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。o室間質(zhì)評(píng)：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級(jí)和地方級(jí)的室間質(zhì)評(píng)。可以理解為 “各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)比”。2/20/

6、2022整理ppt23o臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。o 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA 抗HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽性顯色的情況。2/20/2022整理ppt24o靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。o相對(duì)靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）100%o測定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤（pannel）及臨床標(biāo)本陽性率。2/

7、20/2022整理ppt25o特異性特異性： 真陰性標(biāo)本的檢出能力。o相對(duì)特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）100%o測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標(biāo)本陰性率。2/20/2022整理ppt26Elisa結(jié)果的影響因素o 試劑盒的選擇 o 標(biāo)本o 加樣與稀釋o 溫育o 洗版o 顯色o 質(zhì)控2/20/2022整理ppt27試劑盒的選擇o 同行的試劑使用情況o 上級(jí)部門對(duì)試劑實(shí)際使用的綜合評(píng)價(jià)o 使用臨界值質(zhì)控血清進(jìn)行實(shí)際檢測比較,選擇林敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)試劑盒2/20/2022整理ppt28標(biāo)本o應(yīng)注意避免溶血 o在5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4、超過一周測定的需20保存o盡量避免

8、反復(fù)凍融（少量分裝）2/20/2022整理ppt29加樣和稀釋o 加樣本的準(zhǔn)確性（個(gè)人因素和實(shí)驗(yàn)條件）o 盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶）o 各種試劑盒標(biāo)本的稀釋使用，嚴(yán)格按照說明是操作2/20/2022整理ppt30溫育o 溫度o 水浴箱o 發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)板2/20/2022整理ppt31洗版o 手洗o 洗板機(jī) （微孔液體殘留45s）2/20/2022整理ppt32顯色o 通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng)立即丟棄o 先加A后加B，顯色時(shí)間嚴(yán)格按說明書進(jìn)行o 終止后15內(nèi)比色2/20/2022整理ppt33質(zhì)控o 室內(nèi)質(zhì)控血清o 即刻法2/20/

9、2022整理ppt34ELISA試劑的常見問題原因及其解決o 顯色淺，靈敏度低o 假陽性多，本底高甚至花板o 重復(fù)性不好o 白板2/20/2022整理ppt35顯色淺 靈敏度低序號(hào)原因解決方法1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過長，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運(yùn)輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時(shí)已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。4溫育時(shí)間不夠。嚴(yán)格按照說明書操作。5恒溫箱溫度達(dá)不到37。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。經(jīng)常注意水箱中

10、合適的水位。在保證水不沒過酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。2/20/2022整理ppt366加樣量不足；移液時(shí)抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時(shí)間過長，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長不要超過。12不同批號(hào)試劑中混用

11、不同批號(hào)試劑不能混用2/20/2022整理ppt37假陽性多，本底高甚至花板 序號(hào)原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時(shí)污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時(shí)污染對(duì)先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo)本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。5整個(gè)操作時(shí)間過長、造成反應(yīng)時(shí)間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時(shí)間相差很懸殊）。氣溫高時(shí)更明顯。在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時(shí)）。2/20/2022整理ppt386洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試

12、劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長浸泡時(shí)間。9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí)間。10洗板機(jī)調(diào)試不正確或者有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。2/20/2022整理ppt39重復(fù)性不好 1加樣量多少不一，操作時(shí)間長短不一。重復(fù)同一樣品時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間相同；同時(shí)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后應(yīng)該將酶標(biāo)板放置在微量振蕩器上，充分混合；標(biāo)本保證一致、無污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標(biāo)本后沒有混勻。3重復(fù)實(shí)驗(yàn)的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。4反應(yīng)時(shí)間、溫度等不相同。5標(biāo)本不同（被混淆或者處理不同）6精密度測定方法不標(biāo)準(zhǔn)采用正確的方法操作2/20/2022整理ppt40白板 1忘記加酶嚴(yán)格按照說明書操作。2忘記加顯色液3酶或A、B液被污染失效防止組分被污染，注意保存。4把終止液當(dāng)A液注意液體組分加樣順序。2/20/2022整理ppt41結(jié)果處理o