小鼠卵巢Ⅳ型膠原、間質(zhì)金屬蛋白酶和層粘連蛋白的合成、分布

1、    小鼠卵巢型膠原、間質(zhì)金屬蛋白酶 和層粘連蛋白的合成、分布        【摘要】目的研究型膠原、層粘連蛋白(laminin, LN)和間質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在不同年齡小鼠卵巢中的分布和變化模式。方法利用生物素-抗生物素蛋白間接免疫熒光方法，從蛋白水平觀察型膠原和LN的分布和變化；利用地高辛標(biāo)記的型膠原和MMP-2基因探針進(jìn)行原位雜交，從mRNA水平觀察型膠原和MMP-2的分布和變化。結(jié)果出生5d

2、小鼠卵巢的卵泡基膜和卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium, OSE)基膜處已有少量型膠原和LN分布，基質(zhì)細(xì)胞和OSE中也有分布。型膠原和MMP-2的mRNA在基質(zhì)細(xì)胞和OSE有表達(dá)。發(fā)育期小鼠卵巢中卵泡基膜和OSE基膜中型膠原和LN的含量隨年齡的增加而呈增加趨勢，分布也趨于連續(xù)。顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞、OSE中都有型膠原和LN分布，也有型膠原和MMP-2 mRNA的表達(dá)，其表達(dá)水平明顯比5d時高。成熟期小鼠卵巢型膠原和LN的含量較高。12個月的小鼠卵巢已開始退化，基膜細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的數(shù)量減少，MMP-2 mRNA的表達(dá)量無

3、明顯變化。結(jié)論型膠原和LN在小鼠卵巢發(fā)育過程中含量和分布發(fā)生著動態(tài)變化，可能對卵泡發(fā)育起重要作用?！娟P(guān)鍵詞】卵巢型膠原；層粘連蛋白；間質(zhì)金屬蛋白酶-2【中分類號】R322.6+5，R329.2+4【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】0529-1356(2000)03-231 SYNTHESIS AND DISTRIBUTION OF TYPE COLLAGEN, MATRIXMETALLOPROTEINASE AND LAMININ IN MOUSE OVARIESQIAN Xiao-jing, XU Zeng-lu?, XU Jian, XU Yuan-yuan(Institute of Basic

4、 Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing100005, China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the distribution of type collagen and LN and the expression of type collagen and MMP-2 genes. MethodsBiotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence te

5、chnique, in situ hybridization with diglabeling type collagen and MMP-2 cDNA probe were used. ResultsIn the ovary of 5-day-old neonatal mouse, a small amount of type collagen and LN fluorescence was seen in the basement membrane of follicle and OSE. The expression of type collagen and MMP-2 was obse

6、rved inside OSE and stromal cells. In 15day to 2 month old mouse ovaries, the contents of ECM components increased with advancing age, and the distribution of basement membrane componets were smoothly than before. The mRNA expressions of type collagen and MMP-2 was markedly increased during this per

7、oid. OSE, granulosa and thecal cells were the cells, which contributed to the synthesis of those ECM components and MMP-2. In 2 to 6 month mouse ovaries, the amount of basement membrane ECM components did not change much, and maintain about the same level. In 12-month-old mouse ovary, the contents o

8、f the basement membrane ECM components decreased. ConclusionWe suggest that the type collagen and LN of ovary may play important roles in the process of follicle development.【Key words】Type collagen; LN; MMP-2; Ovary細(xì)胞外間質(zhì)包括多種具有生物活性的大分子，它們在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。卵巢中有豐富的ECM，其中基膜就是由型膠原，層粘連蛋白，巢蛋白制動素和硫酸乙酰肝素等多種

9、ECM成分構(gòu)成的1，但這些成分在卵泡發(fā)育中所起的作用目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選取小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，采用免疫細(xì)胞化學(xué)，組織化學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)方法，研究不同年齡階段的小鼠卵巢中型膠原，LN以及MMP-2的分布和變化規(guī)律，探討這些ECM成分和蛋白水解酶對卵泡的發(fā)育過程所起的作用。為卵泡發(fā)育提供理論基礎(chǔ)，為女性計劃生育研究提供科學(xué)依據(jù)。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供健康5d和15d，1、2、3、6和12個月雌性昆明小鼠，斷頸處死后取卵巢。一側(cè)用中性福爾馬林固定液固定24h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚6m。另一側(cè)用OCT包埋，液氮迅速冷凍，組織塊用恒冷箱切片機(jī)切片，片厚810m。2.試

10、劑兔抗小鼠型膠原抗體和兔抗小鼠LN抗體，由北京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物室提供。生物素化山羊抗兔IgG和熒光素抗生物素蛋白DCS購于北京中山生物技術(shù)有限公司。地高辛DNA標(biāo)記和檢測試劑盒購于德國Boehringer Mannheim。含人型膠原1()鏈cDNA插入片段的重組質(zhì)粒和含人MMP-2 cDNA插入片段的重組質(zhì)粒，均由芬蘭Tuomo Karttunen教授和Helena Autio-Harmainen教授惠贈。3.熒光素-抗生物素蛋白間接免疫熒光染色冰凍切片室溫干燥后，在組織上滴加用PBS稀釋的正常山羊血清，4孵育20min。分別加兔抗小鼠型膠原抗體和兔抗小鼠LN抗體，4孵育過夜。對照片此步以山

11、羊血清代替第一抗體。冷PBS沖洗。加入生物素化的山羊抗兔IgG,4孵育1h。冷PBS沖洗。加入以碳酸氫鈉緩沖液稀釋的熒光素-抗生物素蛋白DCS，4孵育1h。冷PBS沖洗。用含PBS和對苯基二胺(P-phenylenediamine,PPd)的甘油做介質(zhì)封片。標(biāo)本在Olympus反射式熒光顯微鏡下觀察、攝片。4.石蠟組織切片原位雜交及統(tǒng)計學(xué)處理含人型膠原1()鏈cDNA和人MMP-2 cDNA片段的重組質(zhì)粒分別用磷酸鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5菌株，堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量制備，PEG法純化，限制性內(nèi)切酶消化，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收cDNA片段，測定OD260和OD280值，計算DNA濃度。人與小鼠的型

12、膠原1()鏈以及MMP-2均有很高同源性2，3。型膠原1()鏈cDNA和MMP-2 cDNA探針根據(jù)Boringer Mannheim公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行cDNA探針非放射性標(biāo)記及免疫檢測。石蠟組織切片以0.04% DEPC水裱貼于圓玻片上，52過夜烤干。新鮮二甲苯37，30min，室溫10min，梯度酒精脫水，PBS沖洗。新配的0.3% Triton X-100 10min,PBS沖洗。蛋白酶 K(1mg/L)37 30min，冷PBS沖洗。0.25%乙酸酐室溫10min，PBS沖洗。余下步驟按常規(guī)原位雜交方法4操作，終止顯色后梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢并攝片。對照：以雜交液

13、中免去探針作陰性對照。利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度掃描系統(tǒng)對照片做半定量灰度掃描，以其單位面積平均灰度值作為mRNA表達(dá)量的參數(shù)，并將結(jié)果以方差檢驗(yàn)和Student Newman-Keuls(SNK)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)都以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)表示，P<0.05為差異顯著。結(jié)果1.間接免疫熒光染色觀察結(jié)果1.1型膠原(1A)：卵巢整體的熒光強(qiáng)度從5d到2個月一直在增加，進(jìn)入性成熟期后熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定，至12個月時下降。5d時原始卵泡外已有綠色熒光環(huán)繞，初級卵泡的基膜熒光染色弱且不完整。隨年齡增加，各級卵泡基膜熒光逐漸增強(qiáng)，

14、形成完整、光滑的基膜。5d時卵巢基質(zhì)細(xì)胞和OSE有弱熒光，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞未顯示熒光。15d膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞內(nèi)有較弱綠色熒光出現(xiàn)。從15d到2個月卵巢中膜細(xì)胞的熒光一直在增加，其幅度較大。進(jìn)入性成熟期后，膜細(xì)胞熒光強(qiáng)度保持較高水平，變化幅度不大，12個月時減弱。顆粒細(xì)胞變化不明顯。1.2層粘連蛋白(1B)：層粘連蛋白間接免疫熒光分布與變化趨勢基本與型膠原相似，顆粒細(xì)胞之間的熒光比型膠原稍強(qiáng)，部分呈點(diǎn)狀分布。1.3陰性對照片未見綠色熒光。?          3不同年齡小鼠卵巢型膠原原位雜交統(tǒng)計分析Fig.3Den

15、sitometric quantification analysis of insitu hybridization of type collagen 1() mRNAexpression in mouse ovaries of different age     4不同年齡小鼠卵巢MMP-2 mRNA原位雜交統(tǒng)計分析Fig.4Densitometric quantification analysis of in situ hybridization ofMMP-2 mRNA expression in mouse ovaries of differen

16、t age2.cDNA探針的鑒定2.1含型膠原1()鏈cDNA探針的質(zhì)粒，用Bam HI和Hind 進(jìn)行限制性酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察鑒定，酶切片段長度為0.9kb，與預(yù)期相符。2.2MMP-2 cDNA探針的質(zhì)粒，用EcoRI和Hind 進(jìn)行限制性酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察鑒定，酶切片段長度為0.7kb，與預(yù)期相符。3.原位雜交觀察與掃描結(jié)果3.1型膠原mRNA表達(dá)(2A)：5d的小鼠卵巢中，OSE細(xì)胞的型膠原mRNA表達(dá)明顯比卵巢其他細(xì)胞強(qiáng)。原始卵泡的基質(zhì)細(xì)胞中也有少量表達(dá)。卵巢中部的初級卵泡卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中可見極弱的mRNA表達(dá)信號。15d到1個月初級卵泡和次級卵泡顆粒

17、細(xì)胞和部分卵母細(xì)胞的表達(dá)明顯增強(qiáng)，膜細(xì)胞表達(dá)較顆粒細(xì)胞弱。2個月時膜細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)。3個月和6個月卵巢中，大的次級卵泡近腔面的顆粒細(xì)胞和卵丘的顆粒細(xì)胞表達(dá)較基底面強(qiáng)，膜細(xì)胞與顆粒細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度相接近。12個月的卵巢整體表達(dá)稍減弱，但發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞表達(dá)都較強(qiáng)。OSE從5d時即開始表達(dá)型膠原mRNA，以后各個階段型膠原mRNA的表達(dá)一直較強(qiáng)。分別對5和15d、1、2、6和12個月卵巢原位雜交的結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果顯示，卵巢整體型膠原mRNA的表達(dá)從5d到1個月呈增加趨勢，2個月時稍有減弱，6個月稍增強(qiáng)，12個月時再次下降。SNK檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除5d mRNA表達(dá)量與其余各年齡段差異顯著外(

18、P<0.05)，其余各時段之間差異不顯著(P>0.05)(表1，3)。3.2MMP-2 mRNA的表達(dá)(2B)：MMP-2 mRNA的表達(dá)從位置和變化趨勢與型膠原的表1不同年齡小鼠卵巢型膠原mRNA表達(dá)的原位雜交統(tǒng)計分析表Table 1Densitometric quantification analysis of insitu hybridization of type collagen 1() mRNAexpression in mouse ovaries of different age5d5day15d15day1月1 month光密度單位A unit0.0 155

19、7;0.0020.034±0.003?0.0 393±0.005?2月2 month6月6 month12月12 month光密度單位A unit0.0 354±0.008?0.0 375±0.004?0.0 314±0.003?     ?與5d組相比較P<0.05(P<0.05 vs 5 day)mRNA表達(dá)基本相似?；叶葤呙杞Y(jié)果表明，從5d到6個月整個卵巢的MMP-2 mRNA表達(dá)量一直在增加，12個月與6個月表達(dá)量相同。SNK統(tǒng)計結(jié)果顯示只有5d與其他各年齡階段MMP-2 mRNA的表

20、達(dá)差異顯著(P<0.05)，其他各年齡階段之間差異不顯著(P<0.05)(表2，4)。3.3陰性對照片中無藍(lán)色顆粒表2不同年齡小鼠卵巢MMP-2 mRNA原位雜交統(tǒng)計分析表Table 2Densitometric quantification analysis ofin situ hybridization of MMP-2 mRNA expressionin mouse ovaries of different age5d5 day15d15 day1月1 monty光密度單位A unit0.0 140±0.0010.0 423±0.004?0.0 511&#

21、177;0.005?2月2 month6月6 month12月12 month光密度單位A unit0.0 536±0.01?0.0 586±0.012?0.0 586±0.003?     ?與5d組相比較P<0.05(P<0.05 vs 5 day)討論型膠原和LN是基膜的主要成分，兩者分別交聯(lián)成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，再通過巢蛋白使兩者穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)成基膜的骨架，纖粘連蛋白、硫酸乙酰肝素和其他大分子填充于其間，共同構(gòu)成基膜5。5d小鼠卵巢中型膠原和LN已構(gòu)成基膜圍繞在原始卵泡外周。此時卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中均無型膠原和L

22、N的間接免疫熒光，兩種基膜ECM的熒光定位于基質(zhì)細(xì)胞中，型膠原mRNA的表達(dá)也定位于基質(zhì)細(xì)胞中。原始卵泡的基膜可能是由基質(zhì)細(xì)胞分泌的。這與大鼠的情況相近，大鼠出生24h原始卵泡尚未形成時，已有一層薄薄的隔膜把將來要發(fā)育成卵泡的細(xì)胞團(tuán)與周圍的基質(zhì)細(xì)胞分隔開。出生72h后，原始卵泡已經(jīng)形成，每個原始卵泡外都圍繞著一層基膜6。大鼠卵巢中除基質(zhì)細(xì)胞合成型膠原外，原始卵泡內(nèi)還有一些顆粒細(xì)胞可能合成少量的型膠原。15d到1個月期間，顆粒細(xì)胞型膠原的表達(dá)量比5d明顯增加，顆粒細(xì)胞間也可見較弱的型膠原和LN的間接免疫熒光。膜細(xì)胞型膠原mRNA表達(dá)的量增加雖不明顯，可它的型膠原和LN的蛋白合成量明顯增加。顆粒細(xì)

23、胞、膜細(xì)胞共同合成的型膠原和LN補(bǔ)充到正在發(fā)育的卵泡的基膜中去，使基膜型膠原和LN不斷增多，分布也由剛形成時的不均勻到逐漸形成完整、平滑的卵泡基膜包圍在初級卵泡、次級卵泡的周圍。在體內(nèi)基膜成分的旺盛合成，可能對卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖、分化起誘導(dǎo)作用。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)基膜可促進(jìn)培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的粘附、伸展、增殖、分化；生長在基膜上的顆粒細(xì)胞呈多層集合排列，并可促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌孕酮7。卵巢體積的增大，需要有大量的ECM合成，同樣也需要有ECM的降解。5d的小鼠卵巢已可見基質(zhì)細(xì)胞及初級卵泡的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞開始少量表達(dá)MMP-2和型膠原的mRNA，15d后它們在顆粒細(xì)胞的表達(dá)更是明顯增加。提示卵泡發(fā)育

24、的過程中膠原在進(jìn)行積極地改建，膠原的合成和降解同時進(jìn)行，但在發(fā)育期，合成功能可能更旺盛。23個月左右，小鼠卵巢基本發(fā)育完全，處于較成熟相對穩(wěn)定的階段。由于每個動情周期中，都有若干卵泡發(fā)育、排卵、形成黃體或閉鎖等，卵巢一直處于活躍狀態(tài)。26個月卵巢中的膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞保持旺盛活力，卵巢基膜ECM成分和MMP-2的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯一直保持高水平，保證ECM的合成和降解處于動態(tài)變化中，卵泡發(fā)育時合成占優(yōu)勢，而臨近排卵時降解占優(yōu)勢。小鼠性成熟期，型膠原的1()的mRNA含量在卵泡發(fā)育中一直保持高水平與在牛、豬和兔等卵巢中觀察到的結(jié)果一致8，9。但牛的卵泡發(fā)育到大的次級卵泡階段時，基膜的部分成分如

25、6()丟失，型膠原的強(qiáng)度降低，LN的強(qiáng)度增高，基膜由型膠原豐富逐漸變?yōu)長N豐富。LN形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)沒有型膠原形成的結(jié)構(gòu)致密，可能更適應(yīng)卵泡增大的需要5，10。我們的實(shí)驗(yàn)由于采用的是型膠原分子中含量最高的、最常見1()鏈以及型膠原和LN的多抗，未發(fā)現(xiàn)型膠原和LN間接免疫熒光強(qiáng)度隨卵泡發(fā)育有明顯變化。12個月時卵巢開始退化，卵巢型膠原的mRNA表達(dá)量降低，型膠原和LN的熒光強(qiáng)度也有下降。但對于個別處于發(fā)育階段的卵泡，型膠原的mRNA的合成仍很旺盛。在小鼠的卵巢發(fā)育中型膠原和LN以及MMP-2的含量和分布隨年齡的改變而發(fā)生著積極的改變，可能對卵泡發(fā)育起重要作用。本文1A2B見插第7頁【基金項(xiàng)目】高等

26、學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(9704)【作者簡介】錢曉菁(1972)，女(漢族)，北京市人，醫(yī)學(xué)碩士，助教?通訊作者(To whom correspondence should be addressed)錢曉菁（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）許增祿（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）徐健（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）徐園園（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）參考文獻(xiàn)1Luck MR. The gonadal extracellular matrixJ

27、. Oxf Rev Reprod Bio,1994,16(1)：33-85.2Kurkinen M, Condon MR, Blumberg B, et al. Extensive homology between the carboxyl-terminal peptides of mouse 1() and 2() collagenJ. J Biol Chem, 1987,262(18):8496-8499.3Reponen P, Sahlberg C, Huhtala P, et al. Molecular cloning of mouse 72-kDa type collagenase and its expression during mouse developmentJ. J Biol Chem,1