微波輔佐提取-高效液相色譜法測(cè)定果蔬中的Vc含量

1、微波輔佐提取 -高效液相色譜法測(cè)定果蔬中的含量摘要 Vc 在體內(nèi)參與多種反應(yīng),如氧化還原過(guò)程,在生物氧化和還原作用以及細(xì)胞呼吸中起重 要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定果蔬中的 Vc 含量,掌握高效液相色譜法原理及應(yīng)用,熟悉一般樣品前 處理方法,掌握校準(zhǔn)曲線定量法。本實(shí)驗(yàn)采用 Phenomenex 18柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 m ; :3%的乙腈 -0.05 mol/L KH2PO 4水溶液(v/v作為流動(dòng)相,流速 1 mL/min的 HPLC 操作條件;使用微波輔助提取技術(shù)提取水果中的 Vc ,采用紫外檢測(cè)器,在 265nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 Vc 的吸光值。并 與標(biāo)準(zhǔn)系列比

2、較,以保留時(shí)間定性,以峰面積定量。 Vc 濃度在 5100mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積 呈良好的線性關(guān)系(Y=38228x-16642, R2=0.99941 。 關(guān)鍵詞 微波輔佐提取 高效液相色譜法 Vc 紫外檢測(cè)器1. 引言維生素(Vitamin , V 又叫 L-抗壞血酸(Asorbi Aid,是一種水溶性維生素。研究發(fā)現(xiàn), 維生素 C 在人體內(nèi)作為輔酶的成分調(diào)節(jié)機(jī)體代謝,減弱毛細(xì)血管脆性,增加機(jī)體抵抗力;維生素 C 的協(xié)同作用可以提高人體對(duì)鐵的吸收率, 促進(jìn)外傷愈合。 由于 Vc 是一種水溶性的強(qiáng)有力抗氧化 劑并參與膠原蛋白的合成,它同時(shí)還具有防癌、預(yù)防動(dòng)脈硬化、 治療貧血、抗氧化和提高

3、人體免 疫力等功效 Vc 的缺乏可導(dǎo)致多種疾病,其含量高低常作為某些疾病診斷及營(yíng)養(yǎng)分析的重要指標(biāo), 因此 Vc 的定量分析在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域相當(dāng)重要【 1】。下圖是 Vc 的結(jié)構(gòu)式:圖 1. 維生素 c 分子結(jié)構(gòu)式 Vc 在蔬果中普遍存在,尤其是柑桔類水果中含量較高。櫻桃、番石榴、辣椒、獼猴桃等水 果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 微波輔助萃取具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn),在 天然產(chǎn)物、環(huán)境、食品等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。目前測(cè)定 Vc 的方法很多,包括藥典中的標(biāo)準(zhǔn)方法碘量法、紫外分光光度法、熒光分光 光度法、 近紅外分光光度法、 伏安法等【 2】。 各種方法均有自己

4、的獨(dú)特之處, 有些方法要求的實(shí)驗(yàn)條件和操作技術(shù)較高,而有些方法步驟煩瑣, 不利于快速分析。 微波輔助萃取具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn),在天然產(chǎn)物、環(huán)境、食品等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔 助萃取法快速萃取蔬果中的 Vc ,采用高效液相色譜進(jìn)行分析,以 Vc 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積 對(duì)其濃度做校準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品中 Vc 的峰面積,由校準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。2. 實(shí)驗(yàn)部分1. 儀器試劑儀器 :高效液相色譜儀:L-2010(島津香港有限公司;微波萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科 技有限公司;色譜柱:依利特或 Phenomenex18柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5

5、m 。試劑 :乙腈(色譜純,冰乙酸,維生素 C ,磷酸二氫鉀等均為分析純;西紅柿、橘子、小 西紅柿為果蔬樣品。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。Vc 標(biāo)準(zhǔn)溶液:快速準(zhǔn)確稱取 0.025 g , 用 1 mol/L乙酸溶液溶解, 定量轉(zhuǎn)移至 250 mL容量瓶中, 用 1 mol/L乙酸溶液定容,得到 100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,現(xiàn)用現(xiàn)配。色譜條件:流動(dòng)相:3%的乙腈 -0.05 mol/L KH 2 PO4水溶液(v/v ;流速 1 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 265 nm;進(jìn)樣量 10 L。2. 實(shí)驗(yàn)步驟(1 按操作說(shuō)明開(kāi)啟液相色譜儀,設(shè)定方法參數(shù)。 (2樣品準(zhǔn)備:準(zhǔn)確稱取切碎的蔬果 樣品小西紅柿 5.0

6、006g ,西紅柿 5.0220g ,橘子 5.0024g ,以 1 mol/L乙酸 50 mL為萃取溶劑,微波功 率設(shè)為 600 W,萃取時(shí)間為 10 min,萃取溫度設(shè)定為恒溫 50。萃取液過(guò)濾后用 1 mol/L乙酸溶液 定容至 100 mL,制成供試品溶液。 (3定性分析:分別取 10 L 50 mg/L的 Vc 標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試 品溶液,進(jìn) HPLC 分析。根據(jù)保留時(shí)間定性分析蔬果中的 Vc 。 (4 校準(zhǔn)曲線繪制:分別配制 5, 20, 50, 80, 100 mg/L的 Vc 樣品溶液,待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析。以 Vc 色譜峰面積對(duì)濃度作 圖,繪制校準(zhǔn)曲線。 (5 定量分析:供試

7、品溶液經(jīng) 0.45 m微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行 HPLC 分析。 記錄其 Vc 的色譜峰面積, 根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算蔬果樣品中 Vc 的含量, 結(jié)果以 mg/100 g表示。 (6 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,按要求清理好儀器。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪表 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)溶液 /mg·L -15 20 50 80 100 峰面積 A 178151 765478 1892451 2959951 3869048圖 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖可得,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:峰面積 A =38228x -16642,相關(guān)系數(shù) R 2=0.99941。2. 各種樣品提取液色譜圖的繪制分別以小西紅柿、

8、橘子、西紅柿三水果的提取液為樣品,色譜條件為:流動(dòng)相:3%的乙腈 -0.05 mol/L KH2PO4水溶液(v/v ;流速 1 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 265 nm;進(jìn)樣量 10 L,得到 色譜數(shù)據(jù)和色譜圖,如下所示:表 2. 各樣品的數(shù)據(jù)記錄樣品 小西紅柿 橘子 西紅柿 50mg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液 樣品質(zhì)量 /g 5.0006 5.0024 5.022 保留時(shí)間 /min 2.787 2.812 2.804 2.782 峰面積 A 460313 218763 113045 1892451 作不同樣品的峰高 Intensity 對(duì)時(shí)間的曲線,如下圖:2462000040000600008000

9、0 100000I n t e n s i t yt (min(2.79467,101286圖 3. 小西紅柿提取液 HPLC 色譜圖2461000020000300004000050000 60000I n t e n s i t yt (min(2.81600,58957圖 4. 橘子提取液 HPLC 色譜圖246-50005000100001500020000 25000I n t e n s i t yt (min(2.80533,23237圖 5. 西紅柿提取液 HPLC 色譜圖3. 數(shù)據(jù)處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線:峰面積 A =38228x-16642,代入各樣品中維生素 C 色譜峰的峰面積

10、,求出其 濃度; 再根據(jù)提取液的體積 (100mL 和樣品質(zhì)量, 求出各種水果中維生素 C 的含量如下表所示: 樣品 小西紅柿 橘子 西紅柿 樣品質(zhì)量 /g 5.0006 5.0024 5.022 峰面積 A460313 218763 113045 提取液 Vc 濃度 /mg·L-1 12.47659 6.157921 3.392461 樣品 Vc 含量 mg/100g24.9501812.309936.7551994. 討論(1 系統(tǒng)誤差:從 Vc 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法來(lái)看,雖然使用 1mol/L乙酸配制,但這只能抑制 Vc 的電離,并不能阻止其被氧化;而且使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液并不是現(xiàn)配的

11、,已經(jīng)放置過(guò)夜,這更會(huì) 使其中 Vc 被氧化,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際所含的 Vc 量低于標(biāo)識(shí)值。這實(shí)質(zhì)是一種系統(tǒng)誤差,會(huì)導(dǎo)致 實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。(2 本實(shí)驗(yàn)選用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線后,在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定不同樣品 中的含量就很方便, 只需與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照定量就行了。 適用于簡(jiǎn)單體系和大量樣品的分析。 但標(biāo) 準(zhǔn)曲線法受分析色譜條件的影響很大, 容易出現(xiàn)很大的誤差, 實(shí)驗(yàn)時(shí)要特別注意色譜條件的控制。 常用的定量方法有歸一法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法等。 水果樣品的組成比較復(fù)雜, 不 能保證所有組分全部出峰,不宜使用歸一法。雖然內(nèi)標(biāo)法的誤差較小,但要同時(shí)測(cè)定 4種水果樣品中Vc的含量，每種樣品

12、可能都要選擇一種內(nèi)標(biāo)物，這給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很大不便。 （3） 由于微波具有穿透到物質(zhì)內(nèi)部的本領(lǐng)，穿透的深度一般是從幾毫米到幾十厘米的范圍， 隨頻率不同而異。所以除了極大的物體外，微波能做到被加熱的物體里外同時(shí)加熱，這就大大縮 短了加熱時(shí)間。微波的這種加熱速度快、均勻特點(diǎn)使得使用微波輔助提取技術(shù)時(shí)，消耗時(shí)間比傳 統(tǒng)方法明顯減少了，同時(shí)成品消耗、原料、工作量、試劑量等都有顯著的減少 用微波輔助提取法提取水果樣品中的，以提高分析速度和效率。 （4）高效液相色譜具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)速度快、分辨率高、試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)，適用 于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)是為了測(cè)定水果中Vc的含量，由于Vc 的熔點(diǎn)為190192，很難揮發(fā)，又在水果中含量比較低，適宜使用液相色譜法分析。 氣相色譜主要適用于沸點(diǎn)較低、反應(yīng)活性較差、熱穩(wěn)定性很好的物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)不能選