芎簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性比較研究

1、芎簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性比較研究    【摘要】     目的尋找川芎的高效分子標(biāo)記。方法以四川崇州都江堰、新都3個(gè)產(chǎn)地的川芎為材料，應(yīng)用100 條簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性（ISSR）引物、64對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）引物對(duì)30個(gè)川芎個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果篩選到簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性特異性引物共10 條，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性特異性引物共6對(duì)；分別擴(kuò)增出106和256條條帶，多態(tài)條帶百分率分別為22.64%和 22.27%。平均標(biāo)記指數(shù)AFLP 的檢測(cè)效率(1.7

2、8)明顯高于ISSR(0.42)。兩種標(biāo)記基于遺傳相似值聚類(lèi)分析結(jié)果存在著一定的差異,但用Mantel測(cè)試對(duì)兩種方法檢測(cè)的遺傳一致度進(jìn)行相關(guān)性分析表明,它們之間存在著顯著的相關(guān)性( r=0.6975，p=0.014)。結(jié)論川芎具有較低的遺傳多樣性，AFLP更有效于ISSR。     【關(guān)鍵詞】  川芎 簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性    川芎Ligusticum chuanxiong Hort.為傘形科藁本屬的多年生植物，是著名傳統(tǒng)中藥材。以根莖供藥用，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的功效，用于月經(jīng)

3、不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等1。在中國(guó)普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肅、貴州、江蘇等省。四川為川芎道地產(chǎn)區(qū)2，川芎已有一千五百多年栽種的歷史。長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇使不同產(chǎn)地的川芎從外部形態(tài)到有效成分的組成及含量上均存在一定差異3。但目前有關(guān)川芎的研究大多集中在藥用成分分析，藥理作用等方面3，4，遺傳多樣性研究幾乎是空白。因此，尋找高效率鑒定川芎不同種質(zhì)資源的有效分子標(biāo)記技術(shù)方法具有重要意義。    簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性 (ISSR)和 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFL P)這兩種分子標(biāo)記方法已在遺傳群體結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析以及基因圖

4、譜構(gòu)建等方面得到了應(yīng)用58。ISSR與AFLP標(biāo)記均具有無(wú)需預(yù)先知道受試基因組DNA序列, DNA用量少,靈敏度高,對(duì)反應(yīng)條件不敏感,重復(fù)性好,能提供豐富的關(guān)于基因組的信息等優(yōu)點(diǎn), 一般而言, AFLP具有更高的靈敏度,能檢測(cè)出更高的遺傳多樣性,但所需儀器和藥品價(jià)格昂貴,實(shí)驗(yàn)成本高,檢測(cè)過(guò)程繁瑣；ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度不高。選擇合適的分子標(biāo)記對(duì)能否客觀反映研究對(duì)象的狀況具有重要的影響9 。本研究對(duì)ISSR和AFLP 兩種分子標(biāo)記方法進(jìn)行了比較研究, 旨在尋找適合川芎的高效分子標(biāo)記, 以期為川芎的真?zhèn)伪鎰e、遺傳育種及種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。1

5、材料30個(gè)川芎樣品采自四川崇州(編號(hào)110)、都江堰(編號(hào)1120)、新都(編號(hào)2130)，每樣株間隔距離至少5 m以上，每株采集的葉片迅速裝入自封袋中用硅膠干燥保存，并盡快進(jìn)行總基因組DNA的提取。2 方法2.1 基因組DNA的提取采用CTAB,并進(jìn)行改良10。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度儀測(cè)定DNA濃度。2.2  ISSR擴(kuò)增及檢測(cè)ISSR引物(UBC set No.9) 由加拿大哥倫比亞大學(xué)提供。從100條引物篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的引物用于PCR擴(kuò)增。ISSR反應(yīng)體系為 25 l,包括2 l DNA模板( 25 ng/l ) 、0.5 l引物( 1

6、mmol/L)、5 l dNTP (1 mmol/L)、2 l 10 ×PCR buffer，1 U rTaq DNA聚合酶和14.5 l ddH2O。dNTP，rTaq DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司;擴(kuò)增反應(yīng)在PTC100TM(Programmable Thermal Con2troller, MJ Research Inc ,美國(guó)) PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行; PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94 預(yù)變性5 min; 94 變性30 s，4852 退火45 s，72 延伸2 min,共計(jì)45個(gè)循環(huán); 72 延伸7 min; 4 10 min終止反應(yīng);擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳(1&

7、#215;TAE) ,電壓80 V,電泳時(shí)間30 min,然后用EB染色,凝膠成像系統(tǒng)照相,觀察擴(kuò)增結(jié)果。2.3 AFLP擴(kuò)增及檢測(cè)接頭與引物按照文獻(xiàn)11提供的序列,由北京賽百盛公司合成。從選擇性引物中篩選出條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行AFLP分析; AFLP反應(yīng)參照文獻(xiàn)12進(jìn)行。取400 ng總DNA用EcoR (Biolabs)和Mse(Biolabs)雙酶切,酶切產(chǎn)物用T4 - 連接酶( TaKaRa)與接頭連接;然后用無(wú)選擇性堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?94 變性2 min, 94 變性30 s, 56 退火30 s, 72 延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)后, 72 延伸5

8、min, PCR反應(yīng)結(jié)束后,置4 保存。取10 l預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.1×TE稀釋10倍,作為選擇性擴(kuò)增反應(yīng)模板;選擇性擴(kuò)增采用“Touch down”策略。反應(yīng)程序?yàn)? 94 變性2 min, 94 變性30 s, 65 退火30 s (每個(gè)循環(huán)降低0. 7 ) , 72 延伸1 min,共12個(gè)循環(huán); 94 變性30s, 55.5退火30 s, 72 延伸1 min,在進(jìn)行23個(gè)循環(huán)后, 72 延伸5 min， PCR反應(yīng)結(jié)束后，置4 保存；5 l選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物樣品加入等體積甲酰胺染液在95 加熱5 min后立即在冰浴中冷卻。以100 bp Ladder marker作參照，用6%的變

9、性聚丙烯酰胺膠,70 W預(yù)電泳45 min，上樣后75 W電泳70 min；銀染,照相,觀察擴(kuò)增結(jié)果。2.4 數(shù)據(jù)分析將ISSR，AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物每個(gè)條帶均視為一個(gè)分子標(biāo)記(maker)，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。按凝膠同一位置上DNA帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”的格式分別輸入構(gòu)成的ISSR表型和AFLP表型數(shù)據(jù)矩陣用于進(jìn)一步的分析。應(yīng)用POPGENE1. 32軟件對(duì)30個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳參數(shù)分析,計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率( PPB, percentage of polymorphic bands) 、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na , Observed number of al

10、leles ) 、有效等位基因數(shù)(Ne , Effective number of alleles) 、Nei基因多樣性(H,Neis gene diversity) , Shannon信息指數(shù)( I, Shannons Information index) 、Nei遺傳距離(1978) (genetic distance)與遺傳一致度(genetic identity)等參數(shù)。并計(jì)算評(píng)價(jià)分子標(biāo)記效率參數(shù)13：有效多態(tài)率（Effective multiplex ratio，E）和標(biāo)記指數(shù)(marker index ，MI)。E = n × PPB(n為每對(duì)平均引物擴(kuò)增的條帶數(shù))；MI

11、 = E × H。用NTSYS-pc Version 2.10e 軟件進(jìn)行UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic average,非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法)聚類(lèi)分析，得到30個(gè)樣品的聚類(lèi)樹(shù)狀圖。用TFPGA軟件的Mantel檢驗(yàn)軟件檢測(cè)這兩種標(biāo)記的相關(guān)性。3 結(jié)果3.1 ISSR與AFLP的多態(tài)性效率比較利用合成的100條ISSR引物對(duì)30個(gè)川芎進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，初步篩選10條引物(見(jiàn)表1)。這10條ISSR引物共產(chǎn)生了106條擴(kuò)增條帶(1502 700 bp),其中24條是多態(tài)性的(見(jiàn)圖1)。利用合成的64對(duì)AFLP隨機(jī)引

12、物對(duì)30個(gè)川芎進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 初步篩選6對(duì)引物(見(jiàn)表2)。這6對(duì)AFLP引物共產(chǎn)生了256條擴(kuò)增條帶(50500 bp), 其中57條是多態(tài)性的(見(jiàn)圖2)。AFLP擴(kuò)增得到的多樣性參數(shù)高于ISSR擴(kuò)增得到的結(jié)果(見(jiàn)表3)。對(duì)于ISSR 分析,引物多態(tài)性(PPB)為22.64%，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)是0.3218,Shannon信息指數(shù)(I)是0.254 1，Neis基因多樣性(H)為0.1766，有效多態(tài)率(E)和標(biāo)記指數(shù)(MI)分別為2.40和0.42；對(duì)于AFLP分析, PPB為22.27% ,每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)是0.351 8,Shannon信息指數(shù)(I)是

13、0.269 4，Neis基因多樣性(H)為0.189 5，有效多態(tài)率(E)和標(biāo)記指數(shù)(MI)分別為9.42和1.78。表1   篩選出的ISSR引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)目（略）表2  篩選出的AFLP引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)目（略）3.2 同樣樣本遺傳距離與聚類(lèi)結(jié)果比較根據(jù)ISSR 分析表明, Neis 遺傳距離介于0.029 50.074 4之間，所有個(gè)體的平均遺傳距離為0.0518 5，新都種群與都江堰種群之間的遺傳距離較大，崇州種群與都江堰種群之間遺傳距離較小。遺傳一致度的變化范圍為0.931 80.978 3，平均遺傳一致度為0.956 2；AFLP分析得到的30

14、個(gè)川芎的遺傳距離在0.025 40.070 7之間，平均遺傳距離為0.050 2，其中崇州種群與都江堰種群之間遺傳距離較小，崇州與新都種群之間的遺傳距離最大；遺傳一致度在0.932 00.971 1之間，平均遺傳一致度為0.955 4。兩種標(biāo)記的結(jié)果均說(shuō)明，川芎在崇州、都江堰和新都種群之間的相似性較高但也存在著相當(dāng)程度的遺傳分化。但是二者揭示的結(jié)果有一定的差異。用NTSYS-pc Version 2.10e 軟件計(jì)算了基因遺傳相似度，進(jìn)而用UPGMA法聚類(lèi)，結(jié)果(見(jiàn)圖34)表明，ISSR和AFLP標(biāo)記分別得到了基本相近但不完全相同的聚類(lèi)圖。對(duì)于ISSR分析來(lái)說(shuō)，崇州的10個(gè)個(gè)體(110)聚在了

15、一起，都江堰(1120)和新都(2130)出現(xiàn)了極個(gè)別的交叉。AFLP分析來(lái)看，都江堰的聚在一起，崇州的分成了兩部分，新都的也分成了兩部分。表3  ISSR 與AFLP 分子標(biāo)記比較（略）3.3 ISSR與AFLP之間的相關(guān)性分析為了檢測(cè)ISSR與AFLP分析的相關(guān)程度,利用Mantel檢驗(yàn)對(duì)基于兩種標(biāo)記的遺傳一致度矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，兩種標(biāo)記分析的遺傳一致度的成顯著的正相關(guān)( r =0.6975,P=0.014)。4 討論4.1 多態(tài)性效率比較分析ISSR和AFLP的效率對(duì)比研究表明，川芎具有較低的遺傳多樣性以及ISSR和AFLP的多態(tài)性得率很接近。Tusark B.研究

16、苦瓜時(shí)測(cè)得的ISSR和AFLP的多態(tài)性(PPB)分別為74.5%和78.5%14，比較接近，和本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的基本一致。然而AFLP的標(biāo)記指數(shù)比ISSR的高。AFLP 的標(biāo)記指數(shù)高是由于AFLP有比較高的E值，而不是H的較大差異，這和其他人研究發(fā)現(xiàn)也是一致的13。AFLP有比較高的E值是和AFLP標(biāo)記原理有關(guān)。因此,兩種標(biāo)記均能夠有效地應(yīng)用于川芎的遺傳多樣性分析,其分析得到的結(jié)果較為相近,均揭示出川芎具有較低的遺傳多樣性水平。相對(duì)而言,AFLP的檢測(cè)效率比較高。4.2 遺傳距離及聚類(lèi)由ISSR和AFLP分析都得到崇州和都江堰的遺傳距離比較小，說(shuō)明這兩個(gè)地方的川芎親緣關(guān)系比較近。利用Mantel檢測(cè)

17、相關(guān)性，也揭示出兩種標(biāo)記分析所得的遺傳一致度具有顯著的相關(guān)性。而且30個(gè)個(gè)體的聚類(lèi)分析得到ISSR和AFLP標(biāo)記的聚類(lèi)圖形狀也較為相似。因此ISSR與AFLP兩種標(biāo)記均能檢測(cè)出川芎遺傳多樣性,而且二者的分析結(jié)果相互印證。同時(shí)兩種標(biāo)記分析結(jié)果也存在著一定的差異,在AFLP聚類(lèi)中,來(lái)自崇州的10個(gè)個(gè)體沒(méi)有聚在一起而ISSR標(biāo)記的聚類(lèi)圖它們聚在了一起。產(chǎn)生這種差異的原因可能為：兩種標(biāo)記生物學(xué)基礎(chǔ)不同,ISSR標(biāo)記是對(duì)微衛(wèi)星之間的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, AFLP標(biāo)記是對(duì)特異限制性片段的擴(kuò)增；引物不同, AFLP采用的是與接頭序列和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)同源的特異引物，ISSR引物是1524個(gè)堿基的重復(fù)

18、錨定引物,不同的引物檢測(cè)得到的多態(tài)性不一樣,并且多態(tài)片段數(shù)隨著引物數(shù)的增加而增加,必然引起遺傳距離的變異15；AFLP采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,分辨率比較高，能擴(kuò)增出更多的條帶。    總之，AFLP標(biāo)記更為敏感,更能夠檢測(cè)出更為細(xì)微的遺傳變異，是適合于川芎的比較高效的分子標(biāo)記，ISSR較經(jīng)濟(jì)。    【參考文獻(xiàn)】  1劉園, 賈敏如. 川芎品種、產(chǎn)地的歷史考證J. 中藥材，2001,24(5): 364.2丁德蓉, 陳興福,盧進(jìn)，等. 生態(tài)環(huán)境對(duì)川芎產(chǎn)、質(zhì)量的影響J. 生態(tài)學(xué)雜志,1994,13(1): 57. 3

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