重組質粒的酶切鑒定及PCR實驗1

1、重組質粒的酶切鑒定及PCR實驗崔文強201300140012生態(tài)同組者：陳斌 郝書平摘要 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是1986年由Kallis Mullis 發(fā)現(xiàn)。這項技術已廣泛地應用于分子生物學各個領域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態(tài)性的分析等方面。本次實驗旨在通過學習和掌握酶切和PCR反應的基本原理和實驗技術，以驗證重組質粒插入片段大小。關鍵詞 酶切；重組質粒；插入片段；PCR1. 引言將含有外源DNA的轉化子的E.coliDH5菌株進行培養(yǎng)，并用試劑盒提取其質粒DNA，

2、將所提取的DNA用切pUC19質粒的同一種限制性內切酶進行切割以驗證所插入的外源DNA的大小，這就是重組質粒酶切鑒定。接著進行PCR檢驗，PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側的寡核苷酸引物，經酶促合成特異的DNA 片段的體外方法。反應過程由高溫變性，低溫退火和延伸等幾步反應組成一個循環(huán)，然后反復進行，使目的的DNA 得以迅速擴增。置待擴增DNA 于高溫下解鏈成為單鏈DNA 模板，人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側的兩條鏈互補結合，DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物3端開始摻入，沿模板53方向延伸，合成DNA 新鏈。由于每一循環(huán)所產生的DNA均能成為下一次循

3、環(huán)的模板，所以PCR 產物以指數(shù)方式增加，經2530次周期之后，理論上可增加109倍，實際上可增加107倍。PCR 技術具有操作簡便、省時、靈敏度高特異性強和對原始材料質量要求低等優(yōu)點，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏53核酶外切酶活性，不能糾正反應中發(fā)生的錯誤核苷酸摻入，估計每9000個核苷酸會導致一個摻入錯誤，但是錯誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯誤不會擴大。2. 實驗材料和方法2.1實驗材料PRC擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設備，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝膠成像儀 ，模板pUC19重組質粒，寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaR

4、a，-20貯存），dNTPs（TaKaRa，-20貯存），10PCR反應緩沖液（TaKaRa，-20貯存） 高速離心機，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，記號筆，TAE電泳緩沖液(10)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)， DNA相對分子質量標準物DNA Marker kHind，DL5000。2.2實驗方法2.2.1重組質粒的酶切、電泳檢測對于電泳顯示插入片段在2.0kb以上的重組質粒，采用Hind酶切進行驗證。大片段或高產量的重組質粒推薦的反應體系（10l體系）如下：表1質粒酶切反應體系成分體積（l）*4dd H2O6.2261

5、0Buffer（含Mg2+）1.04Re-Puc192.0Hind（15U/l）0.83.2共計10.08L/tube輕彈混勻后，短暫離心，于37 孵育1.5hr后，保存于 -20，備電泳檢測。 取酶切產物10 ul，加入2 ul 10loading buffer，混勻后點樣。 取重組質粒2 ul，加入4L dd H2O，1 ul 10loading buffer，混勻后點樣。以 DNA/HindIII為Marker，點樣順序如表2。100V恒壓電泳約40min。電泳結束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實驗結果。表2重組質粒酶切上樣順序泳道123415161718樣品/HindpUC19

6、/HindRp1-1rp1-1 HindRp7-1Rp7-1 HindpUC19/Hind/Hind樣量L10510101010510作用M對照對照對照M對照2.2.2重組質粒的PCR驗證對于電泳顯示插入片段在2.0kb以下的重組質粒，采用PCR進行驗證。引物此次重組用到的載體是pUC19，限制性內切酶為Hind ，所以選擇Hind 酶切位點兩側一定距離的序列制作引物。由于載體pUC19上兩引物間序列的長度是150bp，所以PCR擴增產物的長度（bp）=150+插入片段的長度。實驗中首先建立反應體系：表3 PCR引物引物名稱引物序列5 3引物長度(mers)Tm()M13F(-47)CGCCA

7、GGGTTTTCCCAGTCAC GAC2464.7M13R(-48)GAGCGGATAACAATTTCACACAGG2457.9表4 PCR反應體系編號組分加量（ul）1dd H2O13.2210Buffer（含Mg2+）2.03dNTP（2.5 mM each）1.64M13F（10M）15M13R（10M）16模板（1-10ng/l）1.07Taq酶（5u/l） 0.2總體積20.0建立體系后將加好樣的PCR管進行標記，放入PCR儀中，設定反應基本參數(shù)如表5所示表5 PCR反應程序項目溫度/ 時間預變性943min變性9425cycles30s復性5830s延伸7275s終延伸7210m

8、in保存42hr（1） 預變性：讓DNA雙鏈充分解離,然后第一次退火過程時候引物可以盡量多的結合到模版上面這主要是為了保險起見，使模板DNA的二級結構充分打開。（2） 變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。（3） 復性：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少。（4） 延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及鎂離子存在的條件下 ， 5-3的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。（5） 終延伸：循環(huán)完成后 使PCR反應完全以提高

9、擴增產量，在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進行。PCR結束之后對產物進行電泳檢測，用1%的瓊脂糖凝膠電泳：20ulPCR產物中加3.0ul 10loading buffer，混合均勻，取5ul 點樣，上樣順序如表6。以DL2000和DL5000為Marker。100V恒壓電泳約40min。電泳結束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實驗結果。表6 PCR產物上樣順序泳道123891011樣品DL20001-11-24-14-2DL5000DL2000樣量L51010101055作用MarkerMarkerMarker3. 實驗結果和分析3.1實驗

10、結果3.1.1重組質粒的酶切電泳結果將重組質粒酶切之后進行瓊脂糖凝膠電泳，成像如圖1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18圖1重組質粒酶切凝膠電泳成像圖第3、4泳道是我們組的結果，分別是重組質粒和酶切后的重組質粒，因為插入片段很小，所以酶切是借用的2組的質粒。由泳道3可以看出重組質粒大小與DNA/Hind中4361的條帶大致平齊，推測其大小為4300，泳道4中自上而下一共五條帶，最上面的條帶 ，第2條帶是切開的pUC19載體，下面三條分別是酶切開的大小為2027、564和125bp的片段。3.1.2重組質粒的PCR驗證結果1. 瓊脂糖電泳展示

11、的克隆片段的PCR擴增結果如下圖： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 圖2 重組質粒的PCR驗證結果我們組的結果是第2、3泳道，與DL2000marker對比來看，大小比250bp的條帶稍大，減去兩引物間序列的長度150bp，可以得出插入片段的大小是125bp。4. 討論4.1注意事項（1） 限制性內切酶的酶切反應屬于微量操作技術，無論是DNA樣品還是酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性并確保樣品和酶全部加入反應體系；（2） 酶切反應的所有塑料制品（Eppendorf管、吸頭等）必須是新的，并經過高溫滅菌，操作時打開使用，操作過程不要求無菌，但要注意手和空氣中雜酶的污染，因

12、此要求環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動，縮短Eppendorf管的開蓋時間。（3） 注意酶切加樣的順序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和DNA，最后加酶。前幾步要把樣品加到管底的側壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液時洗頭應從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液，取出的酶液應立即加入反應混合也得液面以下，并充分混勻。酶液使用完畢后立即放回冰箱，防止酶的失活。（4）Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)，復性溫度=Tm值-(510)，本實驗兩個引物的Tm分別為64.7，57.9，選用退火溫度為58，這是因為在Tm值允許范圍內

13、， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。4.2 PCR反應的要素PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。（1）PCR引物設計PCR反應中有兩條引物，即5端引物和3引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5端引物與位于待擴增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段3端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60

14、%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。（2）模板的制備聚合酶鏈鎖反應PCR的模板可以是

15、DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。（3）反應的控制PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L反應溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時間 95，30s退火溫度和時間 低于

16、引物Tm值5 左右，一般在4555延伸溫度和時間 72，1min/kb(10kb內）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循環(huán)次數(shù) ：一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。（4）擴增產物電泳條帶分析在瓊脂糖展示擴增產物時往往會出現(xiàn)4種干擾現(xiàn)象，即假陰性不出現(xiàn)擴增條帶；假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高；非特異性擴增帶；片狀拖帶。假陰性和假陽性 導致實驗結果出現(xiàn)假陰性和假陽性的原因很多，如引物設計是否合理，兩條引物的濃度是否對稱，模板核酸的制備，酶的質量，PCR循環(huán)條件等，應根據(jù)實驗設計和操作記錄具體分析，再通過重復實驗進行驗證。非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或