骨組織工程種子細胞―――骨髓間充質干細胞研究進展

1、    骨組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞研究進展            作者：鄒慶 楊永宏 時間：2007-11-22 13:12:00                     【關鍵詞】  子細胞 【摘要】 目的 綜述近年來骨

2、髓間充質干細胞體外培養(yǎng)、定向分化為成骨細胞的條件及相關研究進展。方法 查閱大量相關文獻，整理、綜合、分析骨髓間充質干細胞的研究進展。結果 骨髓間充質干細胞具有增殖和分化潛能，在特定條件下可定向分化為成骨細胞，目前傾向于多因素聯(lián)合應用或序貫使用促進骨髓間充質細胞高效表達成骨標志產物，提高成骨率。結論 骨髓間充質干細胞可滿足骨組織工程中種子細胞的要求，具有廣闊的發(fā)展前景和臨床應用價值。關鍵詞 組織工程 骨髓間充質干細胞 成骨骨組織工程學研究內容包括種子細胞、載體、誘導物質以及組織工程化骨組織的臨床應用等諸多方面，其中種子細胞是組織工程研究中首要的、最基本的環(huán)節(jié)。20世紀70年代中期 1 就已證實骨

3、髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有自我增殖能力和分化潛能，而且BMMSCs具有來源廣泛、取材簡單、分化成骨潛能強等特點，成為目前骨組織工程種子細胞研究的重點。1 骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)研究進展干細胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化為兩種以上不同類型組織細胞的細胞;組織干細胞是指發(fā)育成熟的個體內具有多向分化潛能的細胞，目前比較明確的能夠轉化的組織干細胞主要是骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）。Freidenstein 1 發(fā)現(xiàn)了骨髓培養(yǎng)中有呈紡錘

4、狀的少量貼壁細胞，能夠分化形成多種中胚層組織，包括:骨、軟骨、肌腱、肌肉組織、骨髓基質結締組織等，這種形成集落的初始骨髓基質細胞被稱為成纖維細胞樣細胞集落形成單位（Colony forming unit-firbroblastic，CFU-F）。Mingnell 2 認為BMMSCs為存在于骨髓基質中的非造血來源的細胞亞群，Ashton 3 稱其為骨髓基質成纖維細胞。BMMSCs對營養(yǎng)條件要求高，而且含量很低，約為0.001%0.01%，要利用BMMSCs就必需實現(xiàn)其體外分離培養(yǎng)及擴增 4 。BMMSCs培養(yǎng)方法主要有全骨髓培養(yǎng)法和離心培養(yǎng)法，前者是將無菌抽取的骨髓加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，原代

5、培養(yǎng)培養(yǎng)物以造血細胞成分居多，為利于BMMSCs的貼壁生長，可采用DMEN和胎牛血清。胎牛血清終濃度為10%20%，塑料培養(yǎng)瓶較一般玻璃培養(yǎng)瓶更有利于BMMSCs貼壁生長。有人主張用4%醋酸溶解RBC，去除RBC對BMMSCs的貼壁干擾，但有人認為RBC會隨著換液而逐漸被自然去除，對BMMSCs影響不大。細胞融合后以1:2比例傳代，34天換液一次 5 。離心培養(yǎng)法是根據(jù)骨髓中細胞成分比重的不同，采用離心分離法提取單核細胞進行培養(yǎng)。在新鮮無菌的骨髓抽取物中加入抗凝培養(yǎng)液稀釋，以15002000r/min離心2030min，采集交界處的單核細胞層，PBS洗滌23次后，加入培養(yǎng)液接種培養(yǎng)。機體內BM

6、MSC數(shù)量很少，接種數(shù)目太少會影響成骨率，太多對于臨床應用又不太現(xiàn)實，每立方厘米載體接種1×10 6 個細胞就能滿足成骨要求。目前，三維細胞培養(yǎng)技術已在骨組織工程中得到廣泛應用，Kinoshita 6 等利用膠原凝膠載體培養(yǎng)BMMSCs，發(fā)現(xiàn)三維的膠原網絡能有效的刺激成骨細胞分化;Glowacki 7 等采用培養(yǎng)液灌注造成動力性三維細胞培養(yǎng)環(huán)境，增加了細胞的適應生存能力及成骨功能。三維細胞培養(yǎng)能夠有效地種植功能細胞、保持旺盛的細胞活性、最大程度地發(fā)揮細胞的功能。特別是流體力學刺激可通過PGE 2 途徑將力學刺激轉導至細胞內發(fā)揮調節(jié)作用，能夠明顯增加成骨細胞增殖，總蛋白合成和DNA合成

7、增加 8 。2 骨髓間充質干細胞定向分化的研究進展特定條件下，組織干細胞才能向成骨細胞轉化，骨髓間充質干細胞成骨很大程度上依賴于體外培養(yǎng)條件，而且，BMMSCs的定向分化還受到其他多種條件的制約和影響。體外細胞的分化程度決定著成骨的成敗，加入成骨誘導劑可促使BMMSCs向成骨細胞分化?；瘜W物質（如Dex、1，25（OH） 2 D 3 、-GP、維生素C等），細胞因子（如BMP、TGF-、bFGF等）可促進BMMSCs成骨過程中標志產物ALP、BGP、骨橋蛋白、骨涎蛋白等高效表達及礦化結節(jié)形成，提高成骨率。迄今為止，對這些誘導物的作用機制知之甚少，而且不同誘導劑的作用又不盡相同 911 。大量實

8、驗研究發(fā)現(xiàn):Dex作用于BMMSCs后，骨髓間充質干細胞ALP活性增強，骨鈣素（BGP）、骨涎蛋白、骨橋蛋白的合成明顯增加。Dex可促進BMMSCs的成骨分化，早期以促進基質合成為主，后期以促進礦化為主。Dex促進成骨的同時，亦誘導細胞向脂肪分化。Beresford 10 在傳代培養(yǎng)細胞中加入1，25（OH） 2 D 3 ，則抑制其向脂肪細胞轉化，骨鈣蛋白mRNA表達增加，證實向成骨細胞轉化占優(yōu)勢，而僅在傳代培養(yǎng)細胞中加入Dex時，則多向脂肪細胞轉化，這主要是因為Dex促進成骨的同時，能激活BMMSCs表面的糖皮質激素受體，而1，25（OH） 2 D 3 通過降低脂肪細胞晚期基因標志物ap2和

9、脂肪的mRNA水平而抑制糖皮質激素誘導的脂肪形成 11 。-GP可釋放磷酸根，為細胞礦化提供離子環(huán)境，可加速礦化結節(jié)的形成和骨鈣素的合成。維生素C通過延長型膠原轉錄因子的半衰期而最終增加型膠原mRNA的含量 9 。BMP、TGF-、bFGF等細胞因子在骨髓間充質干細胞分化增殖中起著重要作用，但作用不一 1214 。BMP為特異性的骨生長因子，靶細胞為血管周圍具有分化能力的間充質細胞，能夠啟動BMMSCs的成骨過程，其作用機制:促進BMMSCs分化為成骨細胞，引導成骨細胞成骨表型的表達。BMP為唯一具有異位成骨能力的生長因子，可誘導誘導性骨祖細胞（Inducible osteogenic pre

10、cursor cell，IOPC）向定向性骨祖細胞（Detenined osteogenic precursor cell，DOPC）分化，這一特征為骨組織工程的臨床應用提供了廣闊前景。TGF-是較強的促成骨分化因子，在體內能夠增強BMP的誘導成骨作用。TGF-主要是通過促間充質干細胞分裂增殖，為BMP提供豐富的靶細胞;抑制脂肪細胞生成;促進骨細胞產生型膠原，抑制軟骨細胞產生型膠原，增強基質鈣化及對周圍的成骨細胞的趨化作用，三方面提高BMMSCs的成骨效應。bFGF是一種促進血管生成劑，在骨移植時可促進局部毛細血管生長。bFGF能夠促進BMMSCs體外培養(yǎng)CFU-F的形成，促進細胞增殖。bFG

11、F可促進BMMSCs增殖的同時抑制其向成骨細胞分化;bFGF對型膠原蛋白的合成有促進增殖作用，而對于型膠原的影響比較復雜，可能bFGF是通過與細胞膜上bFGF受體結合及一系列信號轉導最終激活DNA-結合蛋白，作用于靶細胞上特異的bFGF反應元件起作用。Kypreos 14 報道bFGF抑制型膠原基因轉導可能是由B-myb一種DNA-結合蛋白介導的，bFGF為具有負性調控作用的細胞因子。Martin 15研究表明:bFGF對BMMSCs具有最強的促分裂作用，與BMP-2聯(lián)合應用促BMMSCs轉化作用強于應用單一細胞因子。骨的生長代謝是由多種細胞因子、化學物質、物理、生物因素等同時參與調節(jié)的過程，

12、目前傾向于多因素聯(lián)合應用或序貫使用。隨著多種骨生長因子調控基因分離成功及成骨機制的分子水平研究的不斷深入，基因轉移技術廣泛用于骨組織工程領域，通過導入標志基因或治療性基因，可致外源性調節(jié)基因表達于修復區(qū)，實現(xiàn)誘導成骨、免疫調節(jié)或成骨調控等預定目的。經BMP、TGF-、潛在性膜蛋白（LMP-1）轉染的BMMSCs已成功應用于骨組織工程化骨組織的構建和骨缺損的修復 16。3 問題及展望近年來關于BMMSCs的研究有了較大發(fā)展，但將BMMSCs應用于臨床，仍面臨許多問題:（1）BMMSCs體外定向分化培養(yǎng)尚未探索出成熟的方法，分離純化細胞群的技術有待進一步提高;（2）BMMSCs實驗僅限于自體移植方

13、面，在異體移植免疫反應問題上有待進一步探索;（3）如何促進BMMSCs與載體材料相容生長并成骨的難題有待進一步解決。隨著三維細胞培養(yǎng)移植模型的進一步發(fā)展、基因轉染技術的完善和生物可降解材料的日趨成熟，BMMSCs移植將有更廣闊的前景，骨缺損、骨不連的治療將進入一個工程化修復重建的嶄新領域。參考文獻1 Friedenstein AJ.Precursor cells of mechanocytes.Int rev cytol，1976，47:317-334.2 Minbuull JJ，Erices A，Conget P.Mesechymal stem cells.Exp Biol Med， 2001，226（6）:507-520.3 Ashton BA，Ashhurst DE，Owen ME.The collagens and glycosaminoglycans of bone marrow stromal cells cultured in vivo in diffusion chambers.Orthop Res，1