一代測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題及解決策略

1、測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題及解決策略一、 PCR常見(jiàn)問(wèn)題1. 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR出現(xiàn)假陰性結(jié)果，可從以下幾個(gè)方面來(lái)尋找原因：1） 模板：模板中有雜蛋白；模板中有Taq酶抑制劑；在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多；模板核酸變性不徹底。2） 酶：酶失活或反應(yīng)時(shí)忘了加酶。3） Mg2+濃度：Mg2+濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。4） 反應(yīng)條件：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。5） 靶序列變異：靶序列發(fā)

2、生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2. 假陽(yáng)性假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。常見(jiàn)原因有：1） 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。2） 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。二是空氣中的小片段核酸污染

3、，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。3. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。三是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減

4、少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法。4. 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。二、 一代測(cè)序結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題及分析原始數(shù)據(jù)圖片為：圖1分析后無(wú)干擾峰的常規(guī)序列圖為：圖2常見(jiàn)問(wèn)題有：1. 釘子峰圖3產(chǎn)生原因：樣品或毛細(xì)管內(nèi)有氣泡或灰塵、結(jié)晶等固體小顆粒反射激光，所以信號(hào)很高，而且所有波長(zhǎng)（4色）都有。解決辦法：灌膠時(shí)不要產(chǎn)生氣泡；使用過(guò)的毛細(xì)管在取下一段

5、時(shí)間后，重新安裝前要清洗；要經(jīng)常擦去灰塵；樣品純化干凈。 2. PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)出現(xiàn)重疊峰1） 單一位點(diǎn)（圖4）或兩個(gè)位點(diǎn)（圖5）的堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼 圖4 圖5產(chǎn)生原因：堿基缺失常見(jiàn)在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中擴(kuò)增得到的PCR片段，如上圖所示，單一位點(diǎn)或兩個(gè)位點(diǎn)的缺失會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼，影響堿基的判讀。解決策略：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測(cè)序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序?；蚴褂梅聪蛞锢^續(xù)測(cè)序，以矯正缺失位點(diǎn)并達(dá)到測(cè)通的目的。如果可以確定該P(yáng)CR片段中不應(yīng)該有缺失的位點(diǎn)，那么可以改變PCR反應(yīng)條件，重新擴(kuò)增。2） 測(cè)

6、序引物堿基缺失 圖6產(chǎn)生原因：測(cè)序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測(cè)序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測(cè)序一開(kāi)始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開(kāi)始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決策略：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化。3. 克隆測(cè)序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊 圖7 產(chǎn)生原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測(cè)序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是送測(cè)序的菌液污染。 解決策略：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y(cè)序。4. 樣品有雜合/突變位點(diǎn) 圖8產(chǎn)生原因：范本中有雜合型突變，也就說(shuō)范本

7、本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來(lái)的雜合位點(diǎn)。如果范本有雜合突變或缺失，那么測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。解決策略：建議將DNA片段克隆到載體再測(cè)序。5. Poly A/T結(jié)構(gòu) 圖9 圖10產(chǎn)生原因：如圖9、10所示，在Poly A/T結(jié)構(gòu)出現(xiàn)后，測(cè)序酶容易在模板上滑動(dòng)，導(dǎo)致Poly A/T結(jié)構(gòu)后的峰形變得雜亂，出現(xiàn)移碼現(xiàn)象。解決策略：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長(zhǎng)的拼接。6. G/C特殊結(jié)構(gòu)區(qū)圖11 產(chǎn)生原因：序列中存在一個(gè)GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)，在該區(qū)域后，信號(hào)迅速減弱。上圖的下半部分是對(duì)測(cè)

8、序反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化后的測(cè)序結(jié)果，在GC特殊結(jié)構(gòu)后，測(cè)序信號(hào)得到一定程度的改善，但是離一般的測(cè)序結(jié)果還是相差甚遠(yuǎn)。 解決策略：針對(duì)該類型的模板，一般應(yīng)從反向進(jìn)行測(cè)序，然后在該特殊結(jié)構(gòu)區(qū)附近將兩個(gè)方向的測(cè)序結(jié)果拼接起來(lái)，得到完整的序列。7. 基因中含有重復(fù)序列 圖12產(chǎn)生原因：樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果和Poly A/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致復(fù)制框滑動(dòng)，較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長(zhǎng)的重復(fù)序列會(huì)使信號(hào)衰減。解決策略：反向測(cè)序有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復(fù)序列區(qū)域(但不是一定都能夠)，通過(guò)多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，拼接可以得到全序列結(jié)果。8. 背景峰雜1） 模板雜 圖13 產(chǎn)生原因：與目的片段條帶大小

9、只相差幾個(gè)堿基的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是無(wú)法用肉眼區(qū)分開(kāi)的。但是DNA測(cè)序反應(yīng)敏感而客觀，可以直接反應(yīng)出模板本身的情況。如上圖所示，該反應(yīng)的背景信號(hào)較高，不利于堿基的判讀。 解決策略：改變PCR條件，重新擴(kuò)增?；蛘呖梢詫⒃揚(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測(cè)序。2） 引物不純 圖14 產(chǎn)生原因：引物不純?cè)斐梢拼a現(xiàn)象，與模板雜在峰圖上均表現(xiàn)為背景峰雜，但是引物不純?cè)诜鍒D上表現(xiàn)的更有規(guī)律，一般在每一個(gè)主峰前都有一個(gè)同一堿基的小峰。 解決策略：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測(cè)序。9. 模板不單一1） 菌液為非單克隆 圖15 產(chǎn)生原因：上圖是pGEM-T載體測(cè)序的結(jié)果，在8

10、3位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即測(cè)序結(jié)果在載體部分很準(zhǔn)確，而進(jìn)入插入片段后出現(xiàn)雙峰的情況。這是由于在接種時(shí)沒(méi)有挑單菌落導(dǎo)致的，當(dāng)兩個(gè)以上的正常的克?。ú迦肫畏较蛳喾矗?，或正?？寺∨c空載體混在一起，而通過(guò)酶切和PCR鑒定很難看出異常，尤其在T-A克隆時(shí)經(jīng)常碰到。 解決策略：重新涂平板挑單菌落測(cè)序。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。2） PCR產(chǎn)物不純 圖16 產(chǎn)生原因：在197bp前測(cè)序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個(gè)高高的A峰，這個(gè)A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個(gè)片段大小為200bp左右的小片段。（注：PCR產(chǎn)物測(cè)序都是

11、以A高峰終止。） 解決策略：對(duì)PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測(cè)序。10. 回文結(jié)構(gòu) 圖17 產(chǎn)生原因：位點(diǎn)94至137是一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號(hào)衰減，出現(xiàn)錯(cuò)誤的判讀。 解決策略：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長(zhǎng)的拼接。11. 酒精峰和染料峰 圖18產(chǎn)生原因：Big dye測(cè)序反應(yīng)試劑盒（BDT）中的big dye mix稀釋過(guò)度出現(xiàn)染料峰，純化的酒精沒(méi)有揮發(fā)干凈則會(huì)出現(xiàn)酒精峰，一般情況下這樣的峰形出現(xiàn)在前200bp的某部分，大部分情況下是不影響測(cè)序結(jié)果的。解決策略：重新安排反應(yīng)。12. 測(cè)序一開(kāi)始就出現(xiàn)雙峰 圖19 產(chǎn)生原因：樣品本身被污染，這常常發(fā)生在樣品

12、為質(zhì)粒和菌液的情況中。當(dāng)使用通用引物測(cè)序時(shí)，如果剛好和樣品中的幾個(gè)質(zhì)粒均能結(jié)合，那么就會(huì)出現(xiàn)這種情況，而且在同一位置上還可能有不止兩個(gè)峰形。樣品不是單一模板，這常常發(fā)生在樣品為PCR產(chǎn)物的情況中。通常PCR樣品含非特異性擴(kuò)增，存在兩條分子量很接近，采用瓊脂糖電泳無(wú)法分開(kāi)的條帶，在測(cè)序時(shí)容易發(fā)生這種情況。樣品中存在兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，這常常發(fā)生在樣品中存在重復(fù)序列的情況下。當(dāng)引物恰好設(shè)計(jì)在重復(fù)序列中時(shí)，那么在重復(fù)序列以外的部分就會(huì)出現(xiàn)雙峰的情況。 解決策略：劃平板挑取單克隆測(cè)序；優(yōu)化PCR體系或者克隆后測(cè)序；選用特異性引物。13. PCR測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)N值 圖20 產(chǎn)生原因：該結(jié)果信號(hào)很強(qiáng)，峰型整齊，但是在該測(cè)序結(jié)果中有多個(gè)位置有重疊峰，出現(xiàn)N值。造成該情況的主要原因很可能是該P(yáng)CR產(chǎn)物中有突變體的存在。在每個(gè)突變位點(diǎn)上有一個(gè)重疊的峰，由于儀器無(wú)法