杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1、杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化蛋白質(zhì)組學(xué)研究         10-08-25 15:29:00     編輯：studa20                   作者：曾建春 樊粵光 劉建仁 易春智 閻亮【摘要】  目的研究杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchym

2、al stem cells,MSCs) 向成骨細(xì)胞定向分化過程的蛋白表達(dá)差異，分析杜仲誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化的可能調(diào)控機(jī)制。方法對杜仲含藥血清干預(yù)前、干預(yù)后第2天、第7天，第14天的細(xì)胞提取總蛋白，通過雙向電泳分離、PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件進(jìn)行分析找出差異蛋白，并進(jìn)行質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫查詢建立功能蛋白質(zhì)組。結(jié)果雙向電泳分離得到641個(gè)蛋白點(diǎn)，選取其中75個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢得到6個(gè)功能蛋白。結(jié)論實(shí)驗(yàn)認(rèn)為補(bǔ)腎中藥杜仲可能通過上調(diào)波形蛋白、核纖層蛋白A的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分化，下調(diào)鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)，釋放細(xì)胞內(nèi)鈣，參與鈣結(jié)節(jié)的形成，與體內(nèi)骨礦化過程有關(guān)。過氧化物歧化酶、膜聯(lián)蛋白A6

3、與細(xì)胞的活力有關(guān)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的分裂增殖與分化，但是否與定向成骨細(xì)胞分化有著密切關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】  杜仲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳Abstract:ObjectiveTo study the protein change in the process of MSCs differentiation to osteoblas guiding by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）, and its  possible regulation mechanisms.MethodsTotal p

4、rotein of cells interfered by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）for 0day, 2days, 7days,14days, was extracted, runouted by two-dimensional electrophoresis and searched for different protein spot by PDQuest-7.3.0 software for analyzing gel picture.Functional proteome was established by m

5、ass chromatographic analysis and data base querying. Results641 protein spots were obtained, chose 75 spots to receive mass chromatographic analysis, and 6 functional protein were obtained by data base querying.ConclusionChinese drug Duzhong（Cortex Eucommiae）may up-regulate  express of  vi

6、mentin and lamin A to promote cell differentiation, down-regulate express of calreticulin to release intracellular Ca2+ which is related to Ca- nodus and bone mineralization in bodies. SOD and annexin A6 are concerned with corpuscular vigor, regulate corpuscular division growth and differentiation,

7、but whether they have intimate relation with directional differentiation from MSCs to osteoblast is unknown, waiting for further research.Key words:Duzhong（Cortex Eucommiae）；  MSCs；  Proteome；  Two-dimensional electrophoresis    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種多功能干細(xì)胞，在不同條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞

8、、心肌細(xì)胞等分化。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主骨，生髓，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲含藥血清能夠誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)細(xì)胞增殖，但對于MSCs向成骨細(xì)胞分化這一復(fù)雜過程的機(jī)制缺乏相關(guān)研究。    蛋白質(zhì)組學(xué)研究是后基因組學(xué)時(shí)代又一重要研究工具，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。本文建立補(bǔ)腎中藥杜仲含藥血清干預(yù) MSCs體外定向分化為成骨細(xì)胞過程，采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析MSCs分化過程中不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)的變化情況，從蛋白質(zhì)分子水平上解釋杜仲干預(yù) MSCs分化的可能機(jī)理。1  器材1.1  動(dòng)物SPF SD大鼠2只，體質(zhì)量150200 g，雌雄不限，由廣

9、州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2  試劑L-DMEM培養(yǎng)基、南美洲胎牛血清（FBS、海克?。?，杜仲（產(chǎn)地云南），0.25%胰酶（GIBCO公司），礦物油、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、CHAPS、DTT、Indoacetamide（sigma），尿素（BBI），硫脲（天津市化學(xué)試劑一廠），PH3-10兩性電解質(zhì)（Bio-Rad），考馬斯亮藍(lán) ( G2 250、R2 250 )、低熔點(diǎn)瓊脂糖、苯甲基磺酰氟( PMSF)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、N,N'-甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉 ( SDS)、溴酚藍(lán)、甘油、無水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、 三氟乙酸(TFA)、無水甲醇、無水乙醇、冰

10、醋酸為國產(chǎn)分析純，購于廣州威佳公司。1.3  器材25，75，175 cm2培養(yǎng)瓶（Coning），酶標(biāo)儀（Thermo），CO2培養(yǎng)箱 (Heraeus)，注射器針頭濾器，0.22 m濾膜（MILLIpore），SIGMA-3K15離心機(jī)（sigma），雙向電泳儀器：Multiphor II（Amersham）、Protean II xi cell（Bio-Rad），IPG固相膠條（17cm，PH：3-10，Bio-Rad），PDQuest凝膠分析軟件( 7.3.0版本) (美國Bio- Rad公司)、 Power look 2100XL凝膠圖像掃描儀(美國UMAX公司)、質(zhì)譜儀器

11、4700 proteomics Analyzer（ABI公司），超低溫冰箱（SANYO）。2  方法2.1  杜仲含藥血清的制備取杜仲藥材粗粉150 g，加70%乙醇10倍量，加熱回流兩次，1 h/次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至300 ml，室溫冷卻，4冰箱保存?zhèn)溆?。將中藥藥液稀釋?.3 g生藥/ml灌胃，1 ml/次，2次/d，連續(xù)給藥4 d，最后一次給藥后1 h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置3 h后置4冰箱過夜，2 500 r/min離心20 min，收集上清液，針頭濾器過濾除菌，置-20保存?zhèn)溆谩?.2  MSCs 分離、純化、擴(kuò)增、誘導(dǎo)SD大鼠以10%水合

12、氯醛0.7 ml經(jīng)腹腔麻醉后，75%酒精浸泡頸部以下軀體5 min，無菌條件下取出雙下肢股骨和脛骨，修潔軟組織后，咬骨鉗修剪骨端，暴露髓腔，10 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，至到骨質(zhì)外觀微微透亮。25 cm2培養(yǎng)瓶收集骨髓沖洗液，放37、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每3天換液1次。當(dāng)原代長滿瓶底90%以上時(shí)0.25%胰酶消化后11傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞長滿75 cm2培養(yǎng)瓶時(shí)，以0.25%胰酶消化后12傳代至長滿4瓶75 cm2培養(yǎng)瓶，再以11傳代至175 cm2培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)其中3瓶加入含10%杜仲血清的L-DMEM，余下的一瓶細(xì)胞立即0

13、.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，并分別于誘導(dǎo)后第2天、第7天、第14天同法收集細(xì)胞，置-80保存?zhèn)溆谩?.3  細(xì)胞總蛋白的提取及定量細(xì)胞解凍后用10 mmol/L Tris/250 mmol/L Srirose（pH 7.0）洗滌3次，加入2 ml裂解液8 mol/L 尿素，4%（W/V）CHAPS，65 mmol/L DTT，2%PHarmalyte-10混勻，加50 g/ml RNase及200 g/ml Dnase，在4放置15 min，再14 000 r/min，4離心30 min，上清bradford法測濃度，-80保存。2.4  第1向等電聚焦從冰箱中取出IPG預(yù)

14、制膠條，用溶脹緩沖液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5CHAPS,0.52%兩性電解質(zhì)，0.02溴酚藍(lán)，1DTT）將膠條泡脹12 h。將膠條取出放入聚焦槽內(nèi)，加入礦物油至沒過上樣杯，上樣量為0.6 mg，并用溶脹buffer稀釋至190 l。對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序（表1）。聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡，第2向SDS-PAGE電泳。表1  等電聚焦程序（略）2.5  膠條平衡將膠條放入平衡緩沖液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L尿素，30甘油，2% SDS，2 DTT，0.02 溴酚藍(lán)）水平振蕩15 min，再將膠

15、條轉(zhuǎn)入平衡緩沖液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L 尿素，30甘油，2% SDS，2.5IAA，0.02 溴酚藍(lán)）水平振蕩15 min。2.6  第2向聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳膠條平衡之前配制丙烯酰胺凝膠4塊，分離膠濃度為12%配制如表2。表2  聚丙烯酰胺凝膠的配置（略）    第2次平衡結(jié)束后，將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝膠上端，并將marker（分子量為97，66，45，30，20.1和14.4 kDa）放到凝膠的一端，再用0.5的瓊脂糖將膠條和marker封

16、嚴(yán)，切忌不能產(chǎn)生氣泡。并將膠板固定于電泳槽內(nèi)。向電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，100 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)條帶全部進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓至120150 V恒壓電泳56 h，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進(jìn)行染色。2.7  考馬斯亮藍(lán)染色將凝膠放入裝有染色液（10硫酸銨，10磷酸，0.12G250，20甲醇）的水平盤內(nèi)，并將水平盤置水平搖床上水平振蕩過夜。收集染色液，將凝膠浸于脫色液（3冰醋酸溶液）中，水平搖床振蕩。最后換成MQ再洗滌30 min。2.8  圖像分析及蛋白鑒定圖像分析及蛋白鑒定：染色后的凝膠用水洗凈后，采用掃描

17、儀進(jìn)行掃描成像，掃描分辨率設(shè)為300 dpi?？既緢D像分析采用PDQuest軟件 (Bio-Rad)進(jìn)行分析；分析過程包括點(diǎn)檢測和編輯、建立和編輯比較組、比較組的數(shù)據(jù)分析及點(diǎn)的計(jì)數(shù)和解釋等，具體方法參照軟件操作說明進(jìn)行。通過對分析膠的對比分析，可以找出比較組中表達(dá)呈現(xiàn)差異的蛋白點(diǎn)，這些差異蛋白點(diǎn)在考染凝膠中的對應(yīng)蛋白斑點(diǎn)將作為質(zhì)譜分析對象。    對目標(biāo)蛋白點(diǎn)進(jìn)行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3 l肽段提取液，與等體積-氰基- 4-羥基肉桂酸飽和的0.1TFA/50乙腈溶液混合后點(diǎn)于質(zhì)譜儀的96孔不銹鋼靶上。按照說明進(jìn)行操作。3  結(jié)果    經(jīng)bradford法測定各組總蛋白濃度分別為0 d 3.24