綠粘帚霉_Gliocladiumvirens_厚垣孢子的生物學(xué)特性

1、Biological Characteristics of ChlamydosporeProduction by Gliocladium virensQIAO Tia n2min1,ZHU Tia n2hui1,LI Fa ng2lia n1,LIU Fu2ping1,ZHANG Yu2hong2(1.College of Forestry and Horticulture,Sichuan Agricultural University,Y aan625014,Sichuan,China;2.Forestry Bureau of Nanchuan City,Nanchuan408400,Cho

2、ngqing,ChinaAbstract:Factors influencing chlamydospore production of Gliocladi um vi rens and characteristic of the spore are studied.The optimal medium for chlamydospore production of G.vi rens is potato2dextrose liquid which is screened out from8kinds of mediums.In PD medium,the optimum culture co

3、nditions are p H3,30,rotating in the light.The acid environment greatly enhances chlamydospore forma2 tion and inhibited production of conidia entirely,and the numbers of chlamydospore production are 8100×106chlamydospores/mL in these conditions for a week;Studies of chlamydospore germinating s

4、how:The optimum germination p H value was p H68and the optimum temperature of germination is25;the germinating rate can reach above90%after48hours;the optimal temperature for storing is under5.K ey w ords:Gliocladi um vi rens;chlamydospore;biological control;biological characteristics綠粘帚霉(Gliocladi

5、um vi rens厚垣孢子的生物學(xué)特性譙天敏1,朱天輝1,李芳蓮1,劉富平1,張毓紅2(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院,四川雅安625014;2.南川市林業(yè)局,重慶南川408400摘要:主要研究綠粘帚霉厚垣孢子的誘導(dǎo)因素及其生物學(xué)特性。營(yíng)養(yǎng)條件和生態(tài)因子試驗(yàn)表明,PD為綠粘帚霉產(chǎn)厚垣孢子的最佳培養(yǎng)基,厚垣孢子產(chǎn)生的最適培養(yǎng)條件為:光照、振蕩、p H3、30,在此條件下可完全抑制其分生孢子的產(chǎn)生,并在1周內(nèi)可產(chǎn)生厚垣孢子8100×106個(gè)/mL;厚垣孢子萌發(fā)試驗(yàn)顯示,25、p H為68為綠粘帚霉厚垣孢子的最佳萌發(fā)條件,48h時(shí)可達(dá)90%以上的萌發(fā)率,在5下貯存比較適宜。關(guān)鍵詞:綠粘帚霉

6、,厚垣孢子,生物防治,生物學(xué)特性中圖分類號(hào):S763.1;S435.111.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1000-2650(200602-0166-05在一些真菌的菌絲中經(jīng)常能見到不規(guī)則的肥大的菌絲細(xì)胞,一般是在不良環(huán)境條件下,菌絲細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)收縮,變圓,外面形成一層厚壁,以抵抗不良環(huán)境,表面一般具有刺或瘤狀突起,這種結(jié)構(gòu)稱為厚垣孢子。Caldwell于1958年首次觀察到厚垣孢子在土壤中比分生孢子更容易存活。在無(wú)隔菌絲中,菌絲的一部分有時(shí)集中儲(chǔ)藏養(yǎng)料,同時(shí)分泌厚壁,兩端形成全封閉的隔膜而與菌絲其他細(xì)胞切斷,形成厚垣孢子;而在有隔菌絲的較老菌絲部位往往形成厚垣孢子,它們一旦遇到適宜的環(huán)境條件它

7、們便萌發(fā)產(chǎn)生菌絲。綠粘帚霉(Gliocladi um vi rens是一種重要的生防頡抗菌,其厚垣孢子在存活等生物學(xué)方面的潛力已得到認(rèn)同1。Lewis2和Beagle-Ristaino3分別用G.vi rens的菌絲體制備物和發(fā)酵生物量用于防治一些蔬菜的立枯病,得出了比分生孢子處理更好的防治效果。G.vi rens的菌絲體和厚垣孢子在土壤中的增殖比分生孢子更好,并且萌發(fā)率也更高3,這為應(yīng)用拮抗體進(jìn)行生物防治找到了新的途徑。第24卷第2期2006年6月四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.24No.2J un.2006收稿日期

8、:2006-03-01通訊作者(Corresponding author。厚垣孢子作為抵抗不良環(huán)境而休眠的生存結(jié)構(gòu),具有更容易大規(guī)模生產(chǎn),容易貯藏、施用和商品化及貨架壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),能滿足作為生物農(nóng)藥的要求,因此,綠粘帚霉大量厚垣孢子的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性的研究對(duì)該頡抗菌生物農(nóng)藥商品化生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義。1材料與方法1.1綠粘帚霉厚垣孢子的誘導(dǎo)1.1.1不同培養(yǎng)基對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響分別配制查氏(NaNO32g,K2HPO41g,KCl 015g,MgSO4015g,FeSO40101g,蔗糖30g,蒸餾水1000mL、G orodkowa(NaCl5g,牛肉膏10g,葡萄糖215g,蛋白胨1

9、0g,蒸餾水1000mL、PD(去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL、豆芽汁蔗糖(黃豆芽100g,蔗糖50g,蒸餾水1000mL、玉米粉(玉米粉6215g,蒸餾水1500mL、大米粒(大米粒100g,蒸餾水1000mL、紅糖(紅糖35g,酵母浸出汁3g,KNO32g,蒸餾水1000mL、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL8種液體培養(yǎng)基。1.1.2光照、振蕩、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響上述每種培養(yǎng)基,每瓶各裝100mL(500mL三角瓶,121滅菌30min后備用。將活化2d的綠粘帚霉(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理室提供平板用孔徑為015cm的

10、打孔器打孔,每瓶接種一菌塊,每種培養(yǎng)基設(shè)4種處理:光照(14W,24h/d+振蕩(120 r/mim;光照(14W,24h/d+靜置;黑暗(用黑光紙包裹+振蕩(120r/min;黑暗(用黑光紙包裹+靜置;每種處理重復(fù)3次,在30下培養(yǎng)20d后,觀察菌絲體形成情況和發(fā)酵液顏色的變化,收集厚垣孢子并計(jì)算發(fā)酵液厚垣孢子數(shù)/mL。對(duì)于產(chǎn)厚垣孢子最多的培養(yǎng)基在最佳條件下繼續(xù)培養(yǎng)30d后,測(cè)定發(fā)酵液中厚垣孢子數(shù)/mL。厚垣孢子的制備參照文獻(xiàn)4的方法,待菌絲叢產(chǎn)生大量的厚垣孢子后,用布氏漏斗濾取菌絲叢,放入盛有100mL無(wú)菌水的勻漿杯內(nèi),5000r/min勻漿3min,使菌絲體充分破碎。用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡

11、下計(jì)算出每1mL懸浮液中厚垣孢子的含量。然后將上述勻漿液1000r/min離心10min,棄上清液,用硅藻土吸附離心杯底的厚垣孢子,放入4冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.3p H對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響將PD培養(yǎng)基調(diào)p H別為:2,3,4,5,6,7,8,9,10共8個(gè)處理,每種處理重復(fù)3次,滅菌后接種綠粘帚霉菌絲塊各一塊,在30、120r/min下,光照(14 W,24h/d振蕩培養(yǎng)7d后,觀察發(fā)酵液p H和顏色變化,收集厚垣孢子(同上,并測(cè)定發(fā)酵液中厚垣孢子數(shù)/mL。1.1.4溫度對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響將PD培養(yǎng)基調(diào)p H為3,滅菌后接種綠粘帚霉菌絲塊一塊,在15、20、25、30、35共5個(gè)溫度分別光

12、照(14W,24h/d振蕩(120r/min培養(yǎng)7d后,收集厚垣孢子(同上,測(cè)定發(fā)酵液中厚垣孢子數(shù)/mL。1.2影響綠粘帚霉厚垣孢子萌發(fā)因素的研究1.2.1厚垣孢子貯存后的活力測(cè)定將制備的厚垣孢子粉劑分別置于4和25下貯存,經(jīng)不同時(shí)間觀測(cè)其萌發(fā)率,具體方法是將厚垣孢子用蒸餾水配制成孢子懸浮液(512×107個(gè)/ mL,在顯微鏡下鏡檢300個(gè)以上厚垣孢子,計(jì)算其萌發(fā)率。1.2.2環(huán)境因子對(duì)厚垣孢子萌發(fā)的影響將厚垣孢子用蒸餾水配成孢子懸浮液(5131×107個(gè)/mL,分別在不同溫度條件下進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn),計(jì)算不同溫度下的孢子萌發(fā)率;同時(shí)用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)配成不同p H值的厚垣孢子懸

13、浮液(25,測(cè)定孢子萌發(fā)率。1.2.3厚垣孢子萌發(fā)所需時(shí)間將厚垣孢子配制成孢子懸浮液(5131×107個(gè)/ mL,置于25培養(yǎng)箱中,每隔4h檢測(cè)一次其萌發(fā)狀況,測(cè)定厚垣孢子萌發(fā)所需時(shí)間。2結(jié)果與分析2.1綠粘帚霉厚垣孢子的誘導(dǎo)條件的研究2.1.1培養(yǎng)基對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響綠粘帚霉在八種不同培養(yǎng)基中呈現(xiàn)了不同的菌絲形態(tài),發(fā)酵液呈現(xiàn)出不同的顏色和澄清度,培養(yǎng)基對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響如表1所示,只有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和G orodkowa培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生分生孢子,但產(chǎn)生的厚垣孢子也不多,而且所設(shè)置的4種培養(yǎng)條件對(duì)分生孢子的產(chǎn)生沒有影響。而在光照和振蕩條件下,PD培養(yǎng)基產(chǎn)生了最多的厚垣孢子(11

14、50×106個(gè)/mL,豆芽汁培養(yǎng)基其次(1115×106個(gè)/ mL,但同時(shí)也產(chǎn)生了大量的分生孢子,其次為豆芽汁、大米粒、查氏培養(yǎng)基,其他組合條件下,PD培養(yǎng)基產(chǎn)厚垣孢子也處于前兩位,綜合上述因素,作者認(rèn)為PD培養(yǎng)基為產(chǎn)厚垣孢子的最佳培養(yǎng)基。761第2期譙天敏(等:綠粘帚霉(Gliocladium virens厚垣孢子的生物學(xué)特性表1綠粘帚霉在不同培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)條件下的厚垣孢子和分生孢子的產(chǎn)生量(×104個(gè)mL-1 Table1The numbers of chlamydospore and conidium produced by GV under differ

15、entcultural medium and conditions(×104chlamydosporesmL-1培養(yǎng)基種類Media光照+振蕩Light+rotation黑暗+振蕩Dark+rotation光照+靜置Light+still黑暗+靜置Dark+still牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基Beef extract peptide medium 2.73(-gA1.7(-fB0.7(-cdC0.7(-cdC查氏培養(yǎng)基Cazpek medium40(+dA 6.7(+dC12.5(+aB 2.3(+bD 玉米粉培養(yǎng)基Corn powder medium10(+eA5(+deB 1.5(+cC

16、1(+cCD 紅糖培養(yǎng)基Sugar medium 2.5(+ghA5(+deB0(+cfC0(+deCPD培養(yǎng)基PD medium150(+aA27.5(+bB10(+bC5(+aD 豆芽汁培養(yǎng)基Bean juice medium115(+bA46.7(+aB0.3(+ceC0(+deCD 大米粒培養(yǎng)基Rice medium55(+cA17.5(+cB0(+cfC0(+deCG orodkowa培養(yǎng)基G orodkowa medium9(-efA 1.7(-fB0.7(-cdBC0(-deBD 注:“-”無(wú)分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”較多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子數(shù)量

17、。差異性檢驗(yàn)(t<0105:小寫字母為培養(yǎng)基間比較;大寫字母為培養(yǎng)條件間比較,含不相同字母為差異性顯著,否則,為不顯著。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+”more conidiospora;“+”numerous conidios pora.“3”chlamydospore numberSignifcant test(t<0105:small letters show difference comparisons among columns;capital letters show difference comp

18、arison among rows,the same letter shows difference is not significant,otherwise,significant.2.1.2光照、振蕩或靜止條件對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響僅從外觀上看,光照和黑暗對(duì)菌絲的生長(zhǎng)繁殖影響不大。在振蕩條件下,培養(yǎng)液的深層空氣充分,綠粘帚霉的菌絲在深層發(fā)酵液中形成了許多不同形態(tài)的菌絲體,而在靜置培養(yǎng)條件下,菌絲只在發(fā)酵液表面形成一層膜狀菌絲體。表1顯示在同一培養(yǎng)基條件下,光照和振蕩更有利于厚垣孢子的產(chǎn)生,光照和振蕩是誘導(dǎo)厚垣孢子的最佳條件,在此狀態(tài)下, PD發(fā)酵液培養(yǎng)30d,每毫升含厚垣孢子可達(dá)2140&#

19、215;106個(gè)。黑暗振蕩次之,黑暗靜置對(duì)厚垣孢子的產(chǎn)生無(wú)實(shí)際意義。作者認(rèn)為,在振蕩條件下,可以看到許多菌絲形成了球狀或餅狀的菌絲體,使菌絲體內(nèi)部形成了厭氧環(huán)境,對(duì)于耗氧菌綠粘帚霉來(lái)說(shuō),正是這種惡劣的厭氧環(huán)境誘導(dǎo)它產(chǎn)生了厚垣孢子,這與文獻(xiàn)4中誘導(dǎo)厚垣孢子產(chǎn)生所創(chuàng)造的厭氧環(huán)境相一致。2.1.3p H對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響p H對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響如表2所示。PD培養(yǎng)液的p H只有在2和3時(shí),綠粘帚霉不產(chǎn)生分生孢子;當(dāng)p H為10時(shí),有大量的分生孢子產(chǎn)生(瓶壁綠色分生孢子,而厚垣孢子的量卻達(dá)到了最小值(1157×105個(gè)/mL;當(dāng)p H為3時(shí),綠粘帚霉產(chǎn)生了最大量的厚垣孢子(8100

20、15;106個(gè)/mL。培養(yǎng)液的p H為3時(shí),大大地刺激了厚垣孢子的產(chǎn)生,同時(shí)抑制了分生孢子的產(chǎn)生,而當(dāng)p H為9和10時(shí),卻刺激了分生孢子的產(chǎn)生,也抑制了厚垣孢子的產(chǎn)生。表2不同pH對(duì)綠粘帚霉厚垣孢子和分生孢子產(chǎn)生的影響Table2The effect of various p H on chlamydospore andconidium producted by GVp H發(fā)酵液p H變化p H change ofculture liquid厚垣孢子數(shù)(×104個(gè)mL-1Chlamydospore number 2253.33(-h3 3.8800(-a46400(+b5 6.56

21、3.3(+g6 6.286.5(+de7 6.590(+d8 6.5243(+c9746(+i107.515.7(+j自然 6.883(+ef注:“-”無(wú)分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”較多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子數(shù)量。含不相同字母為差異性顯著,否則,為不顯著(t<0105。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+ +”more conidiospora;“+”numerous conidios pora;“3”chlamydospore number.the same letter shows dif

22、ference is not significant,otherwise,significant.2.1.4溫度對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響不同溫度對(duì)綠粘帚霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響見圖1,溫度較高有利于厚垣孢子的產(chǎn)生,30是綠粘帚霉產(chǎn)生厚垣孢子的最佳溫度。很明顯,厚垣孢子的861四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第24卷產(chǎn)生是綠粘帚霉在高溫環(huán)境下的一種重要的生存方式,這與Trione 5和Englander 6的觀點(diǎn)相一致 。圖1溫度對(duì)厚垣孢子產(chǎn)生的影響Fig1The effect of the temperature on chlamydospore producted by GV2.2不同環(huán)境條件對(duì)厚垣孢子萌發(fā)的影響貯

23、存溫度、時(shí)間對(duì)厚垣孢子的活力影響如圖2所示,綠粘帚霉厚垣孢子在不同溫度下隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),萌發(fā)率逐漸下降,在5下貯存8個(gè)月后,萌發(fā)率降到70%,而在25下貯存同樣時(shí)間后,萌發(fā)率下降得比較快,已降到25%,說(shuō)明在5下貯存較為適宜 。圖2不同溫度下厚垣孢子貯存后的萌發(fā)率Fig 2The germinating rate of chlamydosporestored under different temperature不同溫度對(duì)綠粘帚霉厚垣孢子萌發(fā)的影響如圖3所示,綠粘帚霉厚垣孢子萌發(fā)的最適溫度為25,25時(shí)萌發(fā)率為92%,而溫度在15以下和35以上幾乎不萌發(fā)。圖4顯示了不同p H 值下綠粘帚霉

24、厚垣孢子萌發(fā)的影響。厚垣孢子萌發(fā)的最適p H 是68,該p H 范圍下的萌發(fā)率為83%90%。綠粘帚霉厚垣孢子萌發(fā)率與時(shí)間的關(guān)系如圖5,厚垣孢子在20h 內(nèi)只有30%的萌發(fā)率,48h 后,萌發(fā)率可達(dá)到92%以上 。圖3不同溫度對(duì)厚垣孢子萌發(fā)的影響Fig 3The germinating rate of chlamydosporeunder different temperature圖4p H 值對(duì)厚垣孢子萌發(fā)的影響Fig 4The germinating rate of chlamydospore under different p H圖5厚垣孢子萌發(fā)率與時(shí)間的關(guān)系Fig 5The relat

25、ionship between germinatingrate of chlamydospore and time3討論與結(jié)論Tsao 4先在25mL 液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng),24h 后用手搖晃使從接種塊上長(zhǎng)出的菌絲破裂成菌絲片斷,靜止培養(yǎng)一周,然后在培養(yǎng)液中加入100mL 滅菌水,使Phytophthora parasitica 菌絲叢沉沒在液體深層,23周后可以獲得大量的厚垣孢子,而分961第2期譙天敏(等:綠粘帚霉(Gliocladium virens 厚垣孢子的生物學(xué)特性生孢子在液體深層被抑制。作者按此方法誘導(dǎo)綠粘帚霉菌的厚垣孢子,卻未能達(dá)到目的,但將PD培養(yǎng)基調(diào)p H為3時(shí),在光照和振

26、蕩的條件下形成了大量的菌絲球后,停止振蕩,這時(shí)菌絲球都沉沒在液體深層,靜止培養(yǎng)一周后作者獲取了大量厚垣孢子,并且完全抑制了分生孢子的產(chǎn)生。Cochrane7曾報(bào)道酸化的并含有葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)大量的厚垣孢子,那么p H為3的PD培養(yǎng)液恰如其分地驗(yàn)證了此說(shuō)法。在作者所選取的8種培養(yǎng)基中,產(chǎn)厚垣孢子最多的是PD培養(yǎng)基,其次為豆芽汁培養(yǎng)基,這與Englander6用V8肉湯和Sush2 ma8用洋蔥頭汁液誘導(dǎo)厚垣孢子的方法有些相似,蔬菜汁在誘導(dǎo)厚垣孢子方面顯示了一定作用。另外,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡,有利于厚垣孢子的產(chǎn)生,很明顯厚垣孢子是GV渡過(guò)惡劣環(huán)境的一種生存方式

27、。厚垣孢子由于具有容易大規(guī)模生產(chǎn),容易貯藏、施用和商品化及貨架壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),我們摸索了綠粘帚霉菌形成厚垣孢子的生態(tài)條件,但厚垣孢子只有在萌發(fā)成菌絲后才可發(fā)揮它的生防作用,Lums2 den9認(rèn)為綠粘帚霉菌的厚垣孢子萌發(fā)后能產(chǎn)生生長(zhǎng)代謝必需的酶,并通過(guò)產(chǎn)生膠霉毒素影響了絲核菌和腐霉菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)。因此我們又進(jìn)一步研究了該菌的厚垣孢子萌發(fā)的最適條件,這為綠粘帚霉厚垣孢子的實(shí)用化提供理論基礎(chǔ),但離體情況下獲得的萌發(fā)條件尚需在田間進(jìn)行驗(yàn)證。參考文獻(xiàn):1Papavizas G C.Biological control of soil2borne fungal propagulesJ.A nn Rew Phytopath,1980,18:369-413.2Lewis J A.Effect of myceial preparations of T richoderma andGliocladi um on populations of Rhizoctonia solani and the inci2 dence of damping2offJ.Phytopathol,1985,75:812-817.3Beagle-Ristaino J E.Survival and proliferation of propagules ofT rich