龜鹿益髓膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎發(fā)病情況、T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的影響

1、龜鹿益髓膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎發(fā)病情況、T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的影響                           作者：張志慧 陳金亮 王殿華【摘要】  目的觀察中藥龜鹿益髓膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎的發(fā)病情況、脾T淋巴細(xì)胞增殖、血中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?撥戀撓跋臁椒檬笛椴捎秒嗍蠹顧柙冉?和完全福氏佐劑制成的抗原-佐劑乳

2、化液誘導(dǎo)大鼠EAE動(dòng)物模型，應(yīng)用龜鹿益髓膠囊作為治療藥物，以潑尼松作為對(duì)照藥物，觀察腦脊髓炎大鼠發(fā)病情況，T淋巴細(xì)胞增殖及血清中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?撥戀乃?平。結(jié)果龜鹿益髓膠囊能明顯抑制EAE發(fā)病，減輕其病情，同時(shí)對(duì)MBP誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖，血清IL?2，IL?6，TNF?撥粱钚雜忻饗砸種譜饔茫?對(duì)ConA誘導(dǎo)脾淋巴增殖，IL-4具有增強(qiáng)作用。結(jié)論龜鹿益髓膠囊對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有增強(qiáng)作用，而對(duì)MBP誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用。而潑尼松片對(duì)兩者誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖均有抑制作用。大劑量龜鹿益髓膠囊能抑制IL?2，IL?6，增強(qiáng)IL?4的活性，調(diào)節(jié)免疫功能，從而

3、抑制EAE發(fā)病，提示中藥龜鹿益髓膠囊通過調(diào)節(jié)體內(nèi)紊亂的免疫功能起到治療作用。 【關(guān)鍵詞】  實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎 龜鹿益髓膠囊 發(fā)病情況 T淋巴細(xì)胞增殖 細(xì)胞因子多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，好發(fā)于2040歲的青壯年女性，致殘率高，復(fù)發(fā)率高，給社會(huì)、家庭和個(gè)人造成了極大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)代研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本病患者腦內(nèi)廣泛存在髓鞘特異性T淋巴細(xì)胞，活化的T淋巴細(xì)胞通過血腦屏障（BBB），可分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子再通過免疫機(jī)制或直接作用導(dǎo)致髓鞘的脫失，而引起腦和脊髓的炎癥反應(yīng)和脫髓鞘變化1。  

4、0; 本實(shí)驗(yàn)中通過中藥龜鹿益髓膠囊對(duì)MS模型(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis , EAE )-腦脊髓炎發(fā)病情況、脾T淋巴細(xì)胞增殖、血清中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?撥戀撓跋歟?來探討本藥治療MS的藥效學(xué)研究。1  材料與方法1.1  動(dòng)物健康wistar大鼠，清潔級(jí)，雌性，70只，體重180200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2002-2003。健康DH豚鼠，清潔級(jí)，雌性40只，體重250350 g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)SCXK（冀）2003-1-003。1.

5、2  試劑及藥物完全福氏佐劑ConA，3H-TdR，MBP，美國Sigma生產(chǎn)。IL-2，IL-4，IL-6，TNF-放免試劑盒購于北京301醫(yī)院放免研究所；龜鹿益髓膠囊，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供；潑尼松片（陽性藥），由浙江仙琚制藥股份有限公司提供。1.3  實(shí)驗(yàn)分組及給藥將70只健康的雌性wistar大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組10只，模型對(duì)照組、潑尼松片組、龜鹿益髓膠囊大劑量（10.24 g生藥/kg）、中劑量（5.12 g生藥/kg）、小劑量（2.56 g生藥/kg）組，每組各12只。按照文獻(xiàn)復(fù)制腦脊髓炎模型2。取新鮮豚鼠，麻醉處死，取出脊髓，除去基膜，

6、稱重后放入組織研磨器，加入等量的生理鹽水研磨成50%的豚鼠脊髓勻漿液。將等體積的脊髓勻漿和完全福氏佐劑充分乳化，形成油包水乳劑，卡介苗的終濃度為6 mg/ml?？瞻捉M乙醚麻醉后4個(gè)足墊及背部共5個(gè)部位，每個(gè)部位0.1 ml，共0.5 ml；模型組乙醚麻醉后在同樣部位注射抗原乳劑。實(shí)驗(yàn)日計(jì)為0 d，以后每天稱重并觀察病情變化，時(shí)間為1個(gè)月。1.4  觀察方法1.4.1  觀察發(fā)病情況觀察各組動(dòng)物的發(fā)病潛伏期、體重?fù)p失情況、發(fā)病率、死亡率、癥狀體征等，癥狀體征參考文獻(xiàn)3評(píng)分：0為正常；1為尾無力；2為后肢無力；3為單側(cè)后肢麻痹；4為雙側(cè)后肢麻痹；5為雙側(cè)后肢麻痹和尿失禁。30

7、d后對(duì)致死率、發(fā)病率、發(fā)病潛伏期、癥狀評(píng)分、體重進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。1.4.2  檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況各組大鼠斷頭處死后，無菌摘取脾臟，分離成單個(gè)細(xì)胞。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入用20%小牛血清RPMI1640（Gibco公司）液含5×106/ml的大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液100 l，然后加入用RPMI1640液稀釋的2 g/ml的ConA100 l，或10 g/ml的MBP100 l4，每組設(shè)復(fù)孔12個(gè)。放37，5% CO2和飽和濕度孵溫箱培養(yǎng)56 h，分別向每孔加入以RPMI1640液配制的10l（370 KBq）/ml 3H-TdR（北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司）20 l（

8、7.4KBq）繼續(xù)培養(yǎng)16 h。用Herveste在96型細(xì)胞收集儀（Tomte公司）收集樣品于1450-421型濾紙膜墊A（Perkin Elmer公司）上，放80，20 min烘干后，裝入1450-423型MicroBeta樣品袋中，加入閃爍液后往wallac 1295-0120型熱封機(jī)封閉放固定架內(nèi)，置MicroBeta tritux 1450型微量液閃儀（perkin Elmer公司）中，檢測(cè)（計(jì)數(shù)）每孔樣品的放射性強(qiáng)度，以cpm值表示。1.4.3  采血檢測(cè)IL-6，IL-2，IL-4，TNF-活性每只發(fā)病動(dòng)物均于瀕死狀態(tài)下處死，空白對(duì)照組及發(fā)病后未死亡動(dòng)物及未發(fā)病動(dòng)物于4

9、周后處死。每只動(dòng)物于處死前均先麻醉，無菌操作心臟采血3 ml只，將采取血液經(jīng)低溫冷凍離心機(jī)離心取血清，然后用全自動(dòng)C-計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)IL-2，IL-6，IL-4，TNF- (具體步驟按照放免藥盒說明書操作)。1.5  統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用美國Stata 4.0版軟件對(duì)發(fā)病潛伏期、體重?fù)p失、癥狀體征、癥狀評(píng)分、T淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)發(fā)病率和死亡率進(jìn)行2檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  各組動(dòng)物臨床發(fā)病情況空白對(duì)照組10只大鼠沒有發(fā)病且體重呈持續(xù)增加，毛色光亮，活動(dòng)正常，食欲較好。模型組大鼠發(fā)病時(shí)出現(xiàn)毛色變暗、體重下降、尾部無力下垂、后肢癱瘓等臨床癥狀，并有大

10、小便失禁，甚至死亡，和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，證明模型復(fù)制是成功的。各給藥組大鼠癥狀有不同程度的改善。見圖14。2.2  龜鹿益髓膠囊對(duì)EAE大鼠發(fā)病率、潛伏期、最高評(píng)分和致死率的影響各組最高癥狀評(píng)分、潛伏期比較。潑尼松片組最高癥狀評(píng)分降低，與模型組比較（P<0.01），發(fā)病潛伏期有延長的趨勢(shì)。龜鹿益髓膠囊小劑量組大鼠發(fā)病潛伏期延長與模型組比較（P<0.05），最高癥狀評(píng)分有降低的趨勢(shì)；龜鹿益髓膠囊大、中劑量組發(fā)病潛伏期延遲（P<0.01），最高癥狀評(píng)分降低（P<0.01）。 結(jié)果見表1。表1  龜鹿益髓膠囊對(duì)EAE大鼠發(fā)病率、潛伏期、最高評(píng)分和致死率的影響

11、（略）2.3  龜鹿益髓膠囊對(duì)腦脊髓炎大鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響在ConA誘導(dǎo)下，模型組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化降低，潑尼松組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化降低，龜鹿益髓膠囊組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化升高，和模型組相比有顯著性差異（P<0.01）；在MBP誘導(dǎo)下，模型組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化升高，潑尼松組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較模型組降低，龜鹿益髓膠囊組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低，和模型組比較有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果見表2。2.4  龜鹿益髓膠囊對(duì)EAE大鼠IL-6，TNF-，IL-2，IL-4的影響模型組血清中TNF-，IL-2和IL-6升高，IL-4降低；潑尼松片組TNF-，IL-2和IL-6降低，IL-4升高，和模

12、型組比較有顯著性差異（P<0.01）；龜鹿益髓膠囊小劑量組各項(xiàng)指標(biāo)較模型組有一定程度的改善，但無顯著性差異（P>0.05）；中劑量龜鹿益髓膠囊可升高IL-4，抑制血清IL-2，IL-6的活性，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；大劑量龜鹿益髓膠囊抑制EAE大鼠血清中IL-2，IL-6的活性，升高IL-4，和模型組比較，有差異或顯著性（P<0.05或 P<0.01）。結(jié)果見表3。百事通3  結(jié)論ConA刺激T細(xì)胞增殖能力代表機(jī)體正常的免疫功能，實(shí)驗(yàn)中ConA刺激的EAE模型大鼠多克隆T細(xì)胞增殖能力顯著低于正常組，而MBP誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞的增殖卻顯著

13、高于正常組，這說明EAE模型大鼠整體免疫功能，即正常的免疫功能是低下的，而針對(duì)MBP的特異性T細(xì)胞增殖是異常增高的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)龜鹿益髓膠囊對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有增強(qiáng)作用，而對(duì)MBP誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用。而潑尼松片對(duì)兩者誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖均有抑制作用，表明中藥龜鹿益髓膠囊和西藥潑尼松片對(duì)本病治療的部分作用機(jī)制是不同的。近年來許多研究表明，細(xì)胞因子參與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)，與MS發(fā)病密切相關(guān)。IL-2，IL-4，IL-6，TNF-在機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用， IL-2，IL-6，TNF-是MS正調(diào)節(jié)因子，IL-4是負(fù)調(diào)節(jié)因子，它們之間具有密切聯(lián)系，均參與MS免疫反應(yīng)，影響MS

14、的病情變化。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，EAE模型大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌處于一種紊亂狀態(tài)，IL-2，TNF-，IL-6異常增高， IL-4異常降低，出現(xiàn)了免疫偏離現(xiàn)象。可見EAE的發(fā)生正是Th細(xì)胞平衡的破壞，通過調(diào)節(jié)分化后細(xì)胞因子水平，平衡Th細(xì)胞活化，校正有害的免疫偏離，是治療的一個(gè)途徑。通過治療后發(fā)現(xiàn)龜鹿益髓膠囊可減輕EAE發(fā)病動(dòng)物的體重?fù)p失，抑制血清IL-6，TNF-a，IL-2的活性；大劑量龜鹿益髓膠囊可明顯延長EAE動(dòng)物的發(fā)病潛伏期，減輕動(dòng)物的體重?fù)p失和臨床癥狀，明顯抑制EAE豚鼠血清IL-6，TNF-，IL-2的活性，增強(qiáng)IL-4的活性，從而對(duì)紊亂的免疫功能有調(diào)節(jié)作用，減輕EAE的發(fā)病和病情的

15、嚴(yán)重程度。表2  龜鹿益髓膠囊對(duì)EAE大鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）表3  龜鹿益髓膠囊對(duì)EAE大鼠血清中IL-4，IL-2，TNF-，IL-6的影響 (略)        MS臨床多見肢體無力，行走不穩(wěn)，甚者癱瘓。根據(jù)其臨床癥狀，屬祖國醫(yī)學(xué)的“痿證”范疇，并從腎、督脈和絡(luò)脈論治，認(rèn)為本病是腎精虧損，絡(luò)脈瘀滯所致，針對(duì)其發(fā)病病機(jī)我們制定了填精益髓，充督活絡(luò)治療原則并研制成功中藥復(fù)方-龜鹿益髓膠囊。本制劑由人參、鹿茸、龜版、菟絲子、何首烏、雞血藤、黃芪、生地等藥組成。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，多發(fā)性硬化存在免疫功能

16、調(diào)節(jié)障礙，現(xiàn)代藥理研究證明上述諸藥可從不同方面調(diào)節(jié)免疫功能。人參能促進(jìn)ConA 和LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量增殖5，6。人參根總皂苷具有佐劑作用，能明顯提高機(jī)體的細(xì)胞免疫7和體液免疫8功能，且沒有常規(guī)佐劑的局部刺激作用。在細(xì)胞因子免疫方面人參皂苷改善脾臟淋巴細(xì)胞IL-2的生成能力，可以明顯提高淋巴細(xì)胞分泌IL-4 mRNA轉(zhuǎn)譯IL-4；鹿茸提取物能明顯增強(qiáng)腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能；何首烏可顯著增強(qiáng)刀豆素A誘導(dǎo)的胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率9。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，龜鹿益髓膠囊治療組各項(xiàng)指標(biāo)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，說明龜鹿益髓膠囊通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能而對(duì)多發(fā)性硬化起到積極的治

17、療作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1呂雪瑩，張鳳蘊(yùn)，王麗群，等.實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的病理研究J.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2000，7（1）：49.2劉曉艷，孫 怡. 補(bǔ)腎固髓片治療多發(fā)性硬化的臨床與實(shí)驗(yàn)研究J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志2001，21（1）：12.3Legge K L，Min B，Bell J J, et al.Coupling of peripheral tolerance to endogenous interleukin 10 promotes effective modulation of myelin-activated T cells and ameliorat

18、es experimental allergic encephalomyelitisJ.J Exp Med,2000，191(12):2039.4Inoue A，Koh CS， Shimada K， et al. Suppression Cell-tansferred experimental autoimmune encephalomyelitis in defibrinated Lewis ratsJ.J Neuroimmunol，1996， 71：131.5李凌夫，王曾力，張 燕，等.人參皂甙Rc對(duì)正常成人外周血NK及LAK細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)藥信息，1996,2：52.6李凌夫，王 冬，張 燕，等. 人參皂甙RE對(duì)正常成人外周血LAK和NK細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)藥信息，1996，3：54.7Hu S, Concha C, CooRay R, et al. Ginseng-enhanced oxidative and phagocytic activities of polymrphonuclear leucocy