益腎健脾膠囊對(duì)人工髖關(guān)節(jié)松動(dòng)影響的細(xì)胞因子學(xué)研究

1、益腎健脾膠囊對(duì)人工髖關(guān)節(jié)松動(dòng)影響的細(xì)胞因子學(xué)研究                             作者：成羿 韓根勇 鄧尚平 樓紅侃  【摘要】  目的 探討益腎健脾膠囊對(duì)人工髖關(guān)節(jié)松動(dòng)的影響。 方法 隨機(jī)選擇準(zhǔn)備行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者20例。采集外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞，每例標(biāo)本分

2、成5份。A組：僅單個(gè)核細(xì)胞，為對(duì)照組；B組：單個(gè)核細(xì)胞+骨水泥微粒；C組：單個(gè)核細(xì)胞+骨水泥微粒+益腎健脾膠囊（3mg/ml）。D組：單個(gè)核細(xì)胞+骨水泥微粒+益腎健脾膠囊（6mg/ml）。E組：單個(gè)核細(xì)胞+骨水泥微粒+益腎健脾膠囊（12mg/ml）。培養(yǎng)48h后，用ELISA測定細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-a、白細(xì)胞介素（IL）-6含量。 結(jié)果 B組的TNF-a和IL-6含量均明顯高于A組(P<0.01)；C組的TNF-a和IL-6含量明顯低于B組(P<0.05)。結(jié)論 骨水泥微?？纱碳蝹€(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6，而益腎健脾膠囊能有效地抑制單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和

3、IL-6。益腎健脾膠囊能防治人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后由TNF-a和IL-6等溶骨性細(xì)胞因子引起的假體周圍的骨溶解，因此該制劑有望成為防治人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的有效藥物。 【關(guān)鍵詞】  益腎健脾膠囊 人工關(guān)節(jié) 假體失效 骨溶解 【Abstract】  Objective  To explore the effects of  YiShenJianPi granule on aseptic cytokine of loosening of prothesis in vitro. Methods  From 20 patients，blood sample

4、 were taken，whose mononuclear cells were isolate and then divided into five groups.Group A：only mononuclear cells，which was control group；group B：mononuclear cells + PMMA particles；Group C：mononuclear cells + PMMA particles + YiShenJianPi granule(3mg/ml)；Group D：mononuclear cells + PMMA particles +

5、YiShenJianPi granule(6mg/ml)；Group E：mononuclear cells + PMMA particles + YiShenJianPi granule(12mg/ml).They were cultured for 48 hours，and the a mount of osteolytic factors such as TNF-a and IL-6 of each group was determined. Results  The levels of TNF-a and IL-6 were much higher in group B th

6、an A，C，D and E(P<0.01).The levels of TNF-a and IL-6 were much lower in group C，D and E than B(P<0.05).  Conclusion  It shows the PMMA particles could stimulate mononuclear cells to excrete TNF-a and IL-6，which can be inhibited by YiShenJianPi granule.By inhibiting bone resorption ass

7、ociated with the particles and TNF-a and IL-6，YiShenJianPi granule may have clinical application in the prevention and treatment of aseptic loosening of prothesis.    【Key words】  YiShenJianPi  Joint prosthesis  Prothesis failure  Osteolysis    目前，人工

8、髖關(guān)節(jié)和人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，被認(rèn)為是效果肯定的病變關(guān)節(jié)成形術(shù)終末治療方法。而假體植入后松動(dòng)給行關(guān)節(jié)置換術(shù)患者手術(shù)前后帶來較大的心理負(fù)擔(dān)和痛苦，給社會(huì)和家屬帶來額外經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此有效地解決這一問題具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的原因歸納為兩大主要因素：一為機(jī)械因素，即微動(dòng)引發(fā)松動(dòng)；另一因素是生物因素，即微粒引發(fā)松動(dòng)。近年來，許多學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究提出多種人工關(guān)節(jié)磨損顆粒， 在骨-骨水泥或骨-假體界面組織中引起的慢性異物炎癥反應(yīng)是造成骨溶解的根本原因。在骨溶解過程中，溶骨性細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞起著重要的調(diào)節(jié)作用。這些溶骨性細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子TNF-a和白細(xì)胞介素IL-6等。作

9、者在以往研究益腎健脾膠囊防治骨質(zhì)疏松中發(fā)現(xiàn)，該中成藥具有抑制骨溶解作用，作者自2007年7月至2008年7月研究通過單個(gè)核細(xì)胞、骨水泥和益腎健脾膠囊混合培養(yǎng)，間接探討益腎健脾膠囊防治因微粒引發(fā)的人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的可能性。    1  材料和方法    1.1  樣本采集  隨機(jī)選擇股骨頸骨折準(zhǔn)備行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者20例中男11例，女9例；年齡4069歲，平均51歲。每例患者采集外周血10ml，肝素抗凝。    1.2  主要試劑和器材  益腎健脾膠囊

10、（×××醫(yī)院制備）。未聚合的骨水泥粉末（美國Zimmer公司制造，微粒直徑為23m），HANK'S液（杭州宏博生物制品公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），RPMI1640溶液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），F(xiàn)ICOLL分離液（上海恒信化學(xué)試劑有限公司），臺(tái)盼藍(lán)（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司），6孔培養(yǎng)板（美國FALCON公司），放免試劑盒（北京東亞免疫技術(shù)研究所，最小檢測濃度<0.3ng)。CO2組織培養(yǎng)箱（美國Heraeus公司），電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法

11、0; 無菌采集準(zhǔn)備行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者外周血10ml，用肝素抗凝。抗凝血以HANK'S液稀釋一倍后，用FICOLL分離液梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞。洗滌3次，加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞記數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至4×105/ml。臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測細(xì)胞活力；向6孔培養(yǎng)板中滴加細(xì)胞懸液，每孔加3ml，最后1孔空置。置37、5%2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培育4h，使細(xì)胞貼壁，利用單個(gè)核細(xì)胞的貼壁性，洗去非貼壁細(xì)胞，留下單個(gè)核細(xì)胞。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液3ml，余4孔中加入含10mg/ml骨水泥的RPMI1640培養(yǎng)液3ml，并于第3、

12、第4和第5孔中分別加入9mg、18mg、36mg益腎健脾膠囊，使其濃度分別為3、6、12mg/ml組。即第1孔為僅有單核細(xì)胞的對(duì)照組，第2孔為單核細(xì)胞+骨水泥組，第3孔為單核細(xì)胞+骨水泥+益腎健脾膠囊（3mg/ml）組，第4孔為單核細(xì)胞+骨水泥+益腎健脾膠囊（6mg/ml）組，第5孔為單核細(xì)胞+骨水泥+益腎健脾膠囊（12mg/ml）組?；靹?，同條件培養(yǎng)48h，取上清液，水平離心機(jī)以1500rpm×10min離心。ELISA測定細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子TNF-a含量和白細(xì)胞介素IL-6含量。    1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  數(shù)據(jù)以均數(shù)&#

13、177;標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析q檢驗(yàn)法檢測不同處理組之間TNF-a和IL-6含量的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2結(jié)果    2.1  TNF-a含量測定結(jié)果  見表1。TNF-含量B組A組(P0.01)；C組B組(P0.05)；D、E組B組(P0.01)；而C、D、E組組間比較無顯著性差異。表1  五組不同處理組TNF-a的含量注：與A組比較，P<0.01；    與組比較，*P<0.05*P<0.01   

14、; 2.2  IL-6含量測定結(jié)果  見表2。IL-6含量B組A組(P0.01)；C、D、E組B組(P0.01)；而C、D、E組組間比較無顯著性差異。表2  五組不同處理組IL-6的含量注：與組比較，P<0.01，    與組比較，*P<0.01百事通    3  討論    人工關(guān)節(jié)置換經(jīng)過30年的發(fā)展和改進(jìn)，長期保留了病變關(guān)節(jié)的功能，明顯提高了患者的工作能力和生活質(zhì)量。隨著人工關(guān)節(jié)使用年限的延長，人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)這一問題逐漸顯現(xiàn)出來，雖然隨著第二、

15、三代骨水泥技術(shù)和生物式固定技術(shù)的發(fā)展，人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的發(fā)生率有所下降，但這一問題仍未得到徹底解決，而且已成為人工關(guān)節(jié)置換術(shù)遠(yuǎn)期失敗的最主要原因，并嚴(yán)重妨礙了人工關(guān)節(jié)的發(fā)展和推廣運(yùn)用。    多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，磨損微粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞性骨溶解是人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的關(guān)鍵。不同的假體材料產(chǎn)生不同的磨損微粒，主要有：骨水泥微粒(PMMA)、超高分子量聚乙烯微粒(UHMWPE)、鈦合金微粒(Ti-6Al-4V)和鈷鉻合金微粒(CoCr)。其過程是：假體磨損產(chǎn)生磨損微粒，刺激巨噬細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子（TNF-a、IL-6等），其中TNF-a與無菌性松動(dòng)的關(guān)系最為密切。這些細(xì)胞因子通過多

16、種途徑產(chǎn)生一系列生物反應(yīng)，最終導(dǎo)致骨吸收和人工關(guān)節(jié)松動(dòng)。    二膦酸鹽能抑制骨吸收，并在骨質(zhì)疏松癥的治療中取得成功。因此，有學(xué)者嘗試用二膦酸鹽來治療微粒引起的假體松動(dòng)。1995年P(guān)ennanen等將二磷酸鹽加入巨噬細(xì)胞raw264培養(yǎng)液中，經(jīng)過培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)二磷酸鹽能明顯抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6等溶骨性因子。范衛(wèi)民等也認(rèn)為二磷酸鹽可明顯抑制TNF-a的分泌，從而抑制骨溶解，防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)。    作者在研究防治骨質(zhì)疏松中發(fā)現(xiàn)，益腎健脾膠囊具有抑制骨吸收作用，骨組織形態(tài)劑量學(xué)檢測顯示，治療組的破骨細(xì)胞數(shù)和骨吸收陷窩數(shù)

17、顯著低于模型組；且益腎健脾膠囊具有整體調(diào)治作用，即該藥同時(shí)具有促進(jìn)成骨、抑制破骨、加速骨礦化等作用。本實(shí)驗(yàn)作者又從細(xì)胞因子學(xué)角度探討益腎健脾膠囊防治假體松動(dòng)的可能性。    單個(gè)核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞為同一來源，在功能上有相同之處，很多學(xué)者以單個(gè)核細(xì)胞代替巨噬細(xì)胞進(jìn)行人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的病因研究。本研究通過人體外周血單個(gè)核細(xì)胞與骨水泥混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，骨水泥微粒可刺激單個(gè)核細(xì)胞分泌大量的TNF-a和IL-6，再次說明微粒在人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)中起著重要作用，但當(dāng)單核細(xì)胞+骨水泥微粒+益腎健脾膠囊混合培養(yǎng)48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清液中的TNF-a和IL-6含量下降，說明益腎健脾膠囊能

18、顯著抑制單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6等溶骨性因子，抑制這些溶骨性因子引起的破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨溶解，從而能夠阻斷人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的發(fā)展過程。    同時(shí)本實(shí)驗(yàn)以3、6、12mg/ml三種不同濃度的益腎健脾膠囊觀察其對(duì)單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然三組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可看出，隨著益腎健脾膠囊濃度的增高，單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6的量逐漸減少，進(jìn)一步說明益腎健脾膠囊可明顯抑制單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-a和IL-6等溶骨性因子，從而防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)。因此益腎健脾膠囊有望成為防治人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的有效藥物。目前國內(nèi)外患者對(duì)綠色天然藥物需求日益擴(kuò)大，中醫(yī)藥治療多靶點(diǎn)、有效低毒的特點(diǎn)無疑具有良好的開發(fā)和推廣前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 范衛(wèi)民，王青，陶松年，等.人工關(guān)節(jié)松動(dòng)病因的研究.中華骨科雜志，1998，18（9）：518521.2 Pennanen N，Lapinjoki S，Urtti A，et al.Effect of liposomal and Biphosphonates on the