殼聚糖海藻酸鈉生物微膠囊進(jìn)展

1、殼聚糖海藻酸鈉生物微膠囊進(jìn)展關(guān)鍵詞：殼聚糖；海藻酸鈉；生物微膠囊 摘要?dú)ぞ厶亲鳛橐环N陽離子聚電解質(zhì)，由于其良好的生物相容性、原料易得及價(jià)格便宜而倍受從事生物微膠囊研究的科學(xué)工作者的關(guān)注。本文綜述了殼聚糖和海藻酸鈉制備生物微膠囊的原理、方法、影響因素和應(yīng)用背景。 自從AMSun發(fā)明海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）生物微膠囊（簡稱微膠囊）以來，微膠囊技術(shù)廣泛用于人工器官研制，動植物細(xì)胞、微生物及酶固定化，藥物控制釋放1，使得微膠囊在生物醫(yī)學(xué)工程以及其它生物技術(shù)領(lǐng)域具有了廣泛的應(yīng)用前景。 制備微膠囊的原理有多種，其中通過聚電解質(zhì)絡(luò)合原理制備微膠囊是采用較多的一種。通過這種原理制備微膠囊的顯著優(yōu)

2、點(diǎn)是制備過程溫和，微囊化的生物活性物質(zhì)在制備過程中活性損失很少或不損失。通過這種原理制備微膠囊所選用的陰、陽離子聚電解質(zhì)材料也有多種，本文著重介紹殼聚糖和海藻酸鈉這兩種天然聚電解質(zhì)材料制備微膠囊的原理、方法、影響因素和應(yīng)用背景。 1殼聚糖和海藻酸鈉反應(yīng)原理 殼聚糖是通過甲殼素脫乙?；苽涞奶烊桓叻肿又辨湺嗵?，化學(xué)名稱為（1-4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖。海藻酸鈉是存在于褐藻類中的天然高分子，從其結(jié)構(gòu)上看是由-1，4結(jié)構(gòu)的D型甘露糖醛酸的鈉鹽（M）和-1，4結(jié)構(gòu)的L型古羅糖醛酸的鈉鹽（G）共聚而成。由于殼聚糖分子鏈上有大量的伯氨基，海藻酸鈉的分子鏈上有大量的羧基，所以殼聚糖和海藻酸鈉可以

3、通過正、負(fù)電荷吸引形成聚電解質(zhì)膜，反應(yīng)簡圖如下： 2制備方法 采用上述原理制備殼聚糖海藻酸鈉微膠囊，在制備方法上，可以分為一步法217、兩步法18和復(fù)合法19。 2.1一步法 采用一步法主要有兩種方式。一種方式是將殼聚糖和氯化鈣的混合溶液直接滴入海藻酸鈉溶液中反應(yīng)形成微膠囊；最終得到了含有殼聚糖沉積層、殼聚糖海藻酸鈉絡(luò)合層和海藻酸鈣凝聚層共三層，內(nèi)部是液態(tài)的微膠囊24。另外一種方式是反向操作，即將海藻酸鈉溶液滴入殼聚糖和氯化鈣的混合溶液中形成微膠囊417。 2.2兩步法 這種合成方法類似于傳統(tǒng)的APA微膠囊的制備方法。過程簡述如下18： (1)海藻酸鈉溶液滴入氯化鈣溶液形成海藻酸鈣凝膠珠； (

4、2)海藻酸鈣凝膠珠再和殼聚糖反應(yīng)形成微膠囊； 2.3復(fù)合法 復(fù)合法是在上述兩種方法基礎(chǔ)上建立起來的，先制備殼聚糖海藻酸鈉微膠囊，然后再以雙功能團(tuán)分子對微膠囊的表面進(jìn)行修飾，制備過程如下19： (1)海藻酸鈉溶液乳化、凝膠化； (2)凝膠化海藻酸鹽與殼聚糖進(jìn)行反應(yīng)形成微膠囊； (3)微膠囊用戊二醛、1，6-己二異氰酸脂或苯四甲酸二酐溶液進(jìn)行表面交聯(lián)。 上述三種制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。一步法的顯著優(yōu)點(diǎn)是制備方法簡單，成囊速度快，微囊化物質(zhì)不容易在制備過程中流失，比較適合于蛋白分子的微囊化。但是，由這種方法制備的微膠囊球性度和光潔度較差，制備過程中微膠囊之間容易粘接。兩步法制備的微膠囊球性度和光潔度好，

5、但是制備過程相對繁瑣；而且，在制備海藻酸鈣膠珠時(shí)，微囊化物質(zhì)容易流失，因此，這種方法相對而言更適合于細(xì)胞的微囊化。復(fù)合法制備的微膠囊強(qiáng)度較好，但也存在著制備過程繁瑣這樣的缺點(diǎn)，而且制備條件激烈。因此，這種方法較適合于對環(huán)境不很敏感的某些微生物進(jìn)行微囊化。 3影響微膠囊性能的主要因素 在殼聚糖海藻酸鈉微膠囊的研究中，主要考察的因素有：殼聚糖分子量、pH值和溶液濃度等。這些因素對微膠囊性能的影響程度主要是通過對微膠囊的強(qiáng)度和控釋性來表征的。 3.1殼聚糖分子量對微膠囊強(qiáng)度與控釋性的影響 從Polk等5和Goosen等18的實(shí)驗(yàn)可以得出這樣一個(gè)結(jié)論：殼聚糖分子量對微膠囊的強(qiáng)度和控釋性的影響是最主要的

6、。 polk等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：高分子量殼聚糖制備的微膠囊強(qiáng)度較低；低分子量殼聚糖制備的微膠囊強(qiáng)度較高；而二者按照一定比例混合制備的微膠囊的強(qiáng)度最高。Goosen等發(fā)現(xiàn)：隨著殼聚糖分子量的降低，制備的微膠囊強(qiáng)度提高。但是，當(dāng)殼聚糖的分子量過低時(shí)，所制備的微膠囊的韌性或者彈性開始降低。 polk等發(fā)現(xiàn)：牛血清白蛋白在高分子量殼聚糖制備的微膠囊中釋放速度要比在低分子量殼聚糖制備的微膠囊中慢，而在混合殼聚糖制備的微膠囊中釋放的速度最慢。Huguet等67也發(fā)現(xiàn)，高分子量殼聚糖制備的微膠囊釋放血紅蛋白的速度要慢于低分子量殼聚糖制備的微膠囊。 根據(jù)微膠囊強(qiáng)度和控釋性分析，殼聚糖分子量對制備微膠囊性能的影響主

7、要由兩方面調(diào)控：殼聚糖進(jìn)入海藻酸鈉體系發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的深度；單個(gè)殼聚糖分子結(jié)合海藻酸鈉負(fù)電荷位點(diǎn)數(shù)，或者說在海藻酸鈉分子間架橋的能力。對于同樣分子量的殼聚糖來講，如果進(jìn)入海藻酸鈉體系越深，所形成微膠囊的強(qiáng)度就會越高，控釋性也相應(yīng)就越強(qiáng)；而對于不同分子量的殼聚糖來講，如果進(jìn)入海藻酸鈉體系的深度一樣，分子量越大的殼聚糖和海藻酸鈉結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)就越多或者說在海藻酸鈉間架橋的能力就越強(qiáng)，所形成的微膠囊的強(qiáng)度也會越高，控釋性相應(yīng)就會越強(qiáng)。介于這兩點(diǎn)，無論大分子量的殼聚糖還是小分子量的殼聚糖對微膠囊強(qiáng)度和控釋性分別都有正反兩方面的影響。因此，很好地控制分子量的大小是決定微膠囊性能的關(guān)鍵因素。 3.2pH值 對

8、微膠囊強(qiáng)度和控釋性的影響pH值也是影響微膠囊性能的一個(gè)主要因素。在微膠囊的制備、后處理和存放過程中，殼聚糖溶液、后處理溶液和存放溶液的pH值對微膠囊的性能都有一定影響。 polk等5發(fā)現(xiàn)：pH值為5.5時(shí)，制備的微膠囊強(qiáng)度最高；高于或低于5.5，制備的微膠囊強(qiáng)度略有下降。Knorr等2為了提高微膠囊的強(qiáng)度，在制備微膠囊后，用不同種類和不同pH值的緩沖溶液對微膠囊進(jìn)行后處理。結(jié)果表明：使用不同溶液進(jìn)行后處理，微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度不同。磷酸鹽緩沖溶液處理的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度最差；pH3的硼砂緩沖溶液處理的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度相對較好，能承受住6.28103Pa的壓力；而pH89TrizmaBase溶液處理的微膠

9、囊的41機(jī)械強(qiáng)度最好，能承受住2.18104Pa的壓力。 huguet等67和Kim等8發(fā)現(xiàn)：隨著pH值的升高，微膠囊釋放蛋白的速度增加；而且釋放速度隨蛋白分子量的降低而增加。最近，Lee等9分別用不同pH值的殼聚糖溶液對愈創(chuàng)木酚甘油醚進(jìn)行微囊化，結(jié)果表明：在pH等于4.8時(shí)，微膠囊的控釋性最強(qiáng)，釋放愈創(chuàng)木酚甘油醚的速度最慢；在pH值低于或高于4.8時(shí)，微膠囊的控釋性都較弱，釋放愈創(chuàng)木酚甘油醚速度都較快。另外，Polk等5在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：同樣條件下制備的微膠囊在不同pH值的存放溶液中所表現(xiàn)的控釋性也不同，微囊化的牛血清白蛋白釋放速度隨著存放溶液pH的降低而減慢。 pH值對微膠囊的各方面的性能產(chǎn)生

10、影響，是因?yàn)橛绊懥藲ぞ厶撬鶐щ姾?、空間構(gòu)象以及和海藻酸鹽的相互作用。另外，pH值對包埋物質(zhì)的空間構(gòu)象以及所帶電荷也會有一定的影響，從而對微膠囊的控釋性也產(chǎn)生影響。 3.3殼聚糖濃度對控釋性的影響 polk等5考察0.1（wv）到0.2（wv）的殼聚糖溶液制備微膠囊時(shí)，發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白的釋放速率隨殼聚糖濃度的升高而升高。但是Kim等8發(fā)現(xiàn)：隨著殼聚糖的濃度的繼續(xù)升高，如從0.25（wv）升高到1（wv），微囊化牛血清白蛋白的釋放速率開始逐漸減慢，微膠囊的控釋性增強(qiáng)。Huguet等6的試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，當(dāng)用0.2（wv）的殼聚糖溶液制備微膠囊時(shí)，制備過程中微囊化的血紅蛋白釋放90以上；而用0.8

11、（wv）的殼聚糖溶液制備微膠囊時(shí)，制備過程中微囊化的血紅蛋白釋放僅1。 上述試驗(yàn)說明，殼聚糖濃度對微膠囊控釋性的影響應(yīng)該分成兩個(gè)區(qū)間來考慮，即：在一定低濃度范圍（0.25）內(nèi)隨著殼聚糖濃度的升高，微膠囊的控釋性漸弱；而超出這個(gè)范圍（0.25），隨著殼聚糖濃度的升高，微膠囊的控釋性逐漸增強(qiáng)。 3.4其它因素的影響 除了上述三種因素之外，其它考察的因素有：添加劑、海藻酸鈉濃度、殼聚糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)、成囊反應(yīng)時(shí)間等。 knorr等2和Daly等3發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為一種可塑劑加入到殼聚糖溶液中有利于微膠囊強(qiáng)度的提高。Okhamafe等10發(fā)現(xiàn)乙酸丁二酸羥丙基甲基纖維（HPMCAS）可以作為一種微膠囊的控釋調(diào)節(jié)劑

12、。Polk等5在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度是影響微膠囊控釋性的一個(gè)因素，尤其在使用低分子量殼聚糖制備微膠囊時(shí)，海藻酸鈉濃度的影響就更為顯著。 Dunn等11和Goosen等18對殼聚糖進(jìn)行了化學(xué)改性，目的是通過延長殼聚糖伯氨基的手臂來提高殼聚糖與海藻酸鈉的反應(yīng)活性。然而，殼聚糖的改性并沒有明顯改善微膠囊的強(qiáng)度，說明空間位阻效應(yīng)不是影響微膠囊成囊反應(yīng)的主要因素。Rha等4和Polk等5發(fā)現(xiàn)成囊反應(yīng)時(shí)間對微膠囊性能影響不是很大，可能的原因是殼聚糖和海藻酸鈉絡(luò)合反應(yīng)速度非常快。 4應(yīng)用背景 從殼聚糖海藻酸鈉微膠囊目前的研究結(jié)果來分析，其可能的應(yīng)用背景是：作為藥物控釋載體、細(xì)胞培養(yǎng)微反應(yīng)器、基因運(yùn)載工具和

13、人工器官以及分離介質(zhì)等。 4.1藥物控釋載體 蛋白、多肽等生化物質(zhì)的微囊化是一個(gè)正在發(fā)展而又非常有前景的控釋方法。同時(shí)，微膠囊還可以增加藥物穩(wěn)定性，降低藥物在體內(nèi)的副作用，延長藥物療效?？梢酝ㄟ^控制殼聚糖的分子量、pH值、濃度、離子強(qiáng)度等因素來制備具有不同控釋效果的微膠囊。例如，微囊化的血紅蛋白在4水中，30天內(nèi)僅釋放107；微囊化的胰島素在pH7.4條件下，24小時(shí)釋放78.812；微囊化的硝化呋喃托英在pH7.4的緩沖溶液中，6小時(shí)釋放708013。這些結(jié)果預(yù)示：通過優(yōu)化各種制備微膠囊的參數(shù)，微囊化的血紅蛋白可以作為紅血球的理想替代物；微囊化的胰島素可以作為一種治療糖尿病的緩釋口服藥物；微

14、囊化硝化呋喃托英可以作51為一種治療泌尿系統(tǒng)感染的緩釋口服藥物。 4.2細(xì)胞培養(yǎng)微反應(yīng)器 kim等14用殼聚糖海藻酸鈉微膠囊包埋雜交瘤細(xì)胞取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微囊化培養(yǎng)的細(xì)胞密度可以高于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度兩個(gè)數(shù)量級；微膠囊內(nèi)生產(chǎn)的單抗?jié)舛仁菓腋∨囵B(yǎng)的20倍，因而利于分離產(chǎn)物和提高產(chǎn)物的純度。但是，由于氧擴(kuò)散阻力的存在，固定化細(xì)胞密度隨微膠囊的尺寸增加而相應(yīng)的降低15。 4.3基因運(yùn)載工具和人工器官 alexakis等19將包埋有小牛胸腺DNA的殼聚糖海藻酸鈉微膠囊通過管飼法注入小鼠體內(nèi)，經(jīng)檢測小鼠糞便發(fā)現(xiàn)微膠囊通過小鼠消化系統(tǒng)能夠回收。這表明：殼聚糖海藻酸鈉微膠囊具有一定的強(qiáng)度，可以作為DNA

15、的保護(hù)屏障。孫多先、李濤等20通過海藻酸鈉殼聚糖海藻酸鈉微膠囊對肝細(xì)胞進(jìn)行包埋，微囊化肝細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)液中17天內(nèi)保持活性，能合成并釋放低分子量的蛋白質(zhì)。 4.4分離介質(zhì) 傳統(tǒng)親和色譜分離技術(shù)中存在著傳質(zhì)阻力大、選擇性和配體利用效率低等缺點(diǎn)。微膠囊技術(shù)為如何解決這些問題提供了一個(gè)新思想。Daugulis等16將藍(lán)葡聚糖用殼聚糖海藻酸鈉微膠囊進(jìn)行固定化，并進(jìn)行了從牛血清中分離牛血清白蛋白的嘗試。Li等17也利用類似的方法將牛血清白蛋白從其鹽溶液中進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：殼聚糖海藻酸鹽微膠囊具有很強(qiáng)的吸收能力，有效地增加了配體的利用效率。 5面臨的問題和可能的解決辦法 殼聚糖海藻酸鈉微膠囊的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。但是，這種微膠囊面臨著這樣一個(gè)比較突出的問題：如何在保