液相聯(lián)用研究IS

1、液相聯(lián)用研究IS                 摘要：18名健康受試者隨機(jī)交叉給藥，分別單次（40mg）及多次口服國產(chǎn)5-單硝酸異山梨醇酯緩釋膠囊和迸口緩釋膠囊進(jìn)行人體生物等效性研究。采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測定血漿中IS-5-MN的的濃度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，單次口服國產(chǎn)和進(jìn)口5-單硝酸異山梨醇酯緩釋膠囊的：AUC0-36分分別為7490.65±1144.06g·h/L和7355.38±1007.36g·

2、;h/L，Tpeak分別為4.92±1.31h和4.67±O.79h，Cmax分別為519.15±60.53g/L和523.67±68.99g/L；多次口服達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)：AUC0-36分別為8514.11±1318.07g·h·L-1和8586.87±836.38g·h·L-1，Tpeak分別為4.83±0.94h4.75±1.14h，Cmax分別為570.44±78.89g·L-1和580.43±64.04g·L-1，波動(dòng)系數(shù)FI分別為1

3、35.10±15.53%和134.82±9.71%。對單次及多次給藥所得梯形法計(jì)算的兩者的AUC0-36，Cmax、Tdeak進(jìn)行方差分析和雙單車側(cè)檢驗(yàn)結(jié)果表明兩者具有生物等效性。國產(chǎn)5-單硝酸異山梨醇酯緩釋膠囊單次給藥及多次給藥穩(wěn)態(tài)時(shí)的相對生物利用度分別為101.9±7.3%和99.1±11.9%。關(guān)鍵詞：IS-5-MNHPLC/MS生物等效性5-單硝酸異山梨醇酯（isosorbide5-mononitrate，IS-5-MN）是硝酸異山梨醇酯（isosorbidedinitrate，ISDN）主要代謝產(chǎn)物之一，其主要藥理活性是松弛平滑肌。與硝酸異山梨

4、醇酯相比，IS-5-MN具有吸收迅速、無首過效應(yīng)、生物利用度高等特點(diǎn)。臨床上主要用于預(yù)防心絞痛，在對充血性心力衰竭和血管痙攣性心絞痛的治療方面應(yīng)用日益廣泛。有關(guān)IS-5-MN的測定方法的報(bào)道都是氣相色譜-電子捕獲法或毛細(xì)管電泳-電子捕獲法測定，本試驗(yàn)建立液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（LC/MS）測定血漿中IS-5-MN的濃度，并用此方法對國產(chǎn)1S-MN緩釋膠囊進(jìn)行多劑量人體生物等效性研究?，F(xiàn)將試驗(yàn)方法與結(jié)果報(bào)告如下：材料和方法1.1試藥及試劑被試制劑：國產(chǎn)IS-5-MN緩釋膠囊，40mg/粒，由北京第二制藥廠研制。含量102.6%。批號980103。標(biāo)準(zhǔn)參比制劑：進(jìn)口IS-5-MN緩釋膠囊（商品名：德

5、脈寧），40mg/粒，德國麥克樂制藥公司生產(chǎn)的市售產(chǎn)品，合量：102%，批號1924A7。對照品：IS-5-MN，由北京第二制藥廠提供，批號980127，含量：99.96%。試劑：甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，濃氨水、乙酸乙酯為分析純。1.2儀器及色譜條件Waters公司2690型高效液相色譜系統(tǒng)（帶自動(dòng)進(jìn)樣器），Waters公司PlatformLCZ質(zhì)譜檢測器，Masslynx工作站。3P97（生物利用度計(jì)算程序）由中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)專業(yè)委員會編制。色譜條件：采用WatersC18色譜柱（4m，150mm×2.Onm）；柱溫20；流動(dòng)相：甲醇：氨水溶液（O.03mol·L-1

6、）=2080（pH=7.8），流速O.25ml·min-1，進(jìn)樣量20l。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），選擇性監(jiān)測質(zhì)荷比為（M/Z）190帶負(fù)電荷的分子離子峰，電噴霧電壓3.5KV，干燥氣（N2）流速為368L·min-1，干燥氣溫度為250。1.3受試者及給藥方法18名健康受試者均為男性，年齡22-23歲，身高165-186cm，體重56-80kg。受試者在試驗(yàn)前進(jìn)行體格檢查肝腎功能，心率、呼吸、血壓及心電圖均正常。受試者試驗(yàn)前兩周及試驗(yàn)期同未服用其他任何藥物。試驗(yàn)前均簽署知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)衛(wèi)生部北京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。采用隨機(jī)交叉試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，單次與

7、多次結(jié)合進(jìn)行，18名受試者隨機(jī)分成兩組，第1天禁食12小寸后清晨8時(shí)空腹口服試驗(yàn)藥品，其中9名口服被試制劑，9名口服標(biāo)準(zhǔn)參比制劑，劑量均為40mg，用溫開水100ml吞服。受試者在服藥抽血期間禁姻、酒，服藥后2h給予統(tǒng)一低脂肪飲食。血樣自給藥后1，2，3，4，5，6，8，12，24，36h，取上肢靜脈血3ml。第3天（即48h）晨起8時(shí)受試者按前述方案繼續(xù)服藥（每日口服40mg試驗(yàn)藥品），連服5天，第4、5、6、7、8天早晨服藥前取血漿3ml，供測定谷濃度，以考察是否達(dá)到穩(wěn)態(tài)；第8天服藥后按第1天采血時(shí)間及方法采上肢靜脈血3ml。將血標(biāo)本置于肝素化的試管中，離心（3000r/min，5min）

8、，分離出血漿。-20避光保存至測定。第一次試驗(yàn)結(jié)束二周后交叉給藥重夏實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在醫(yī)生、護(hù)士監(jiān)護(hù)下進(jìn)行。1.5血藥濃度的測定1.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取IS-5-MN標(biāo)準(zhǔn)品25.Omg置100ml容量瓶中用流動(dòng)相溶解并加至刻度成250mg·L-1，取4ml于1OOml容量瓶中用流動(dòng)相稀釋至刻度，使成10mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液待用。1.5.2血樣的預(yù)處理取血漿1ml置5ml離心管中，加乙酸乙酯1ml，振蕩0.5min。離心（3000r·min-1，5min），吸取有機(jī)層至另一試管中；同法提取三次，合并三次提取液， 40水浴中氮?dú)鈸]干，用1 ,液相聯(lián)用研究IS-

9、5-MN緩釋膠囊人體生物等效性(2) 00流動(dòng)相溶解進(jìn)樣。1.5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取空白血漿加人IS-5-MN標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10mg/L）適量使成640g·L-1，再依次稀釋成320，160，80，40，20，10g·L-1系列濃度，按上述方法處理后進(jìn)樣測定。1.6方法學(xué)評價(jià)1.6.1萃取回收率的測定空白血漿中加人IS-5-MN標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1Omg·L-1）適量使成的600，200，20·L-1三個(gè)濃度的樣品,按血樣處理方法處理后進(jìn)樣，另用流動(dòng)相配制相應(yīng)濃度IS-5-MN溶液，不經(jīng)萃取直接進(jìn)相同量的樣以此為標(biāo)準(zhǔn)，將兩組峰面積進(jìn)行比較計(jì)算IS-5-MN的萃取

10、回收率。1.6.2方法回收率及精密度的測定空白血漿中加人IS-5-MN標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1Omg·L-1）適量制成的600，200，20g·L-1的三個(gè)濃度的樣品，按血樣處理方法處理后進(jìn)樣，各濃度日內(nèi)重復(fù)測定5次，并連續(xù)測定5日，計(jì)算其方法回收率及日內(nèi)、日間的精密度。1.7數(shù)據(jù)處理（1）穩(wěn)態(tài)時(shí)Cmax，Tpeak的值均采用實(shí)測值。Cmin是用穩(wěn)態(tài)時(shí)第8天Oh與24h的濃度的平均值。用梯形法計(jì)算AUC0-t。（2）由藥-時(shí)曲線末端相血藥濃度的對數(shù)對時(shí)同t回歸，求算消除速率常數(shù)k及消除半衰期t1/2（3）AUC0-=AUC0-t+c*/k。其中c*為最末取血點(diǎn)濃度，k為消除速率常數(shù)。

11、（4）相對生物利用度（F）按下式計(jì)算：2（Cmax-Cmin）FI= ×100%（Cmax-Cmin）（5）波動(dòng)系數(shù)（FI）用下式計(jì)算:AUC0-t（被試制劑）F=×100%AUC0-t（標(biāo)準(zhǔn)參比制劑）（6）直接用3P97程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以考察兩種制劑的生物等效性。試驗(yàn)結(jié)果1.1色譜圖在選定的條件下測得的質(zhì)譜色譜圖見圖，由圖1可見，血漿中IS-5-MN的保留時(shí)間為：5.32min。其M/Z為190。Fig 1.Chromatogram of IS-5-MN in plasma A plasma sample B Mass spectral of IS-5-mn1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

12、回歸方程將標(biāo)準(zhǔn)曲線測定項(xiàng)下測得的峰面積值S對濃度C進(jìn)行直線回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下。本試驗(yàn)的線性范圍：10640g·L-1，最低檢測濃度為7.5g·L-1。（S/N3）S=57.8273C-345.7710=0.99981.3萃取回收率、方法回收率及精密度的測定結(jié)果：見下表2，IS-5-MN三個(gè)濃度的日內(nèi)、日間RSD皆小于10%。Table3Method recovery and precision of IS-5-mn in plasma(n=5) Concentrationg·l-1Extraction recovery（%）Method recovery

13、（%）Witnin-dayRSD(%)Betwween-dayRSD(%)6002002086.8287.8083.09100.54101.56101.202.003.625.402.435.637.211.4血樣測定結(jié)果18名健康受試者單次及多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)的藥時(shí)曲線見圖2、3。此可以看出，健康受試者國產(chǎn)膠囊與進(jìn)口膠囊所測的所有血漿中藥物濃度均在本試驗(yàn)線性范圍內(nèi)     n-time curves of IS-5-MN after the last dose of multiple dose (40mg,qd) regimenTable2Pharmac

14、okinetics parameters following a single oreldose（40mg）and the last dose of multiple doses（40mg qd）in 18 volunteers ParametersunitSingle oral doseMultiple orel dosedomesticimporteddomesticimportedAVC0-24(g·h·L-1) 7658±11827699±819AUC0-36(g·h·L-1)7490±11447355±1

15、0078514±13188586±836AUC0-(g·h·L-1)7777±10777671±10238910±13888934±860Cmax(g·L-1)519.15±60.53523.67±68.99570.44±78.89580.43±64.04Cmin(g·L-1) 109.35±37.91112.02±15.08Tmax（h）4.92±1.314.67±O.794.83±0.944.75

16、77;1.14Ke（h）0.099±0.0190.094±0.0140.096±0.0170.096±0.013t1/2ke（b）7.276±1.4777.540±1.0557.433±1.2997.313                            

17、;  ±1.017MRT0-36（h）11.099±0.70411.340±0.71211.028±0.89911.021±0.492FI（） 135.10±15.53134.82±9.71F（）101.9±7.3 99.1±11.9 1.6生物利用度研究單次給藥及多次給藥穩(wěn)態(tài)時(shí)國產(chǎn)制劑的相對生物利用度為101.9±7.3%和99.1±11.9%，見表2用3p97程序?qū)Ρ辉囍苿┡c標(biāo)準(zhǔn)參比制劑進(jìn)行生物等效性分析。單次給藥及多次給藥兩制劑梯形法汁算的AUC0-36、Cmax、Tp

18、eak經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換，方差分析結(jié)果、雙單側(cè)檢驗(yàn)及90%可信限判斷的結(jié)果見表3，由表3可見，兩種制劑具有生物具有生物等效性。Table4Results ofstatisticsanalysis SingleoraldoseMultipleoraldoseT1T290%confidential intervalT1T290%confidential intervalInAUC0-t11.2139.67897.8-105.75.554-6.41792.0-105.3InCmax6.8847.35193.8-105.17.3708.91193.2-102.9InTpeak4.4432.9363.8-ll6.83.5442.97190.1-115.5注：t1-0.05（18）=1.746 有關(guān)IS-5-MN血藥家度測定方法國內(nèi)、外報(bào)道均采用氣相色譜-電子捕獲法或毛