儀器分析教程高效液相色譜法(共63頁).ppt

1、20-1概述 高效液相色譜法HPLC是20世紀60年代末70年代初開展起來的一種新型別離分析技術(shù)，隨著不斷改進與開展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)別離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜根底上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較： 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達 103cmmin

2、-1.例如別離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸別離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3h-1，需用20多小時才能別離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)別離出尿中104個組分. l氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20。對于占有機物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行別離和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力

3、，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對別離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進別離條件的參數(shù)，這為選擇最正確別離條件提供了極大方便。 (3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法那么經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的開展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的別

4、離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖20-1，一般可分為4個主要局部：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，別離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲別離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行別離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 1高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系

5、統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量那么隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保存時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機械往復(fù)泵。 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多約530cm，所以柱外展寬

6、又稱柱外效應(yīng)較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩局部。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。一般在別離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和別離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過別離柱時不再洗

7、脫其中固定相，保證別離技的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料20m一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 在液相色譜中，有兩種根本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被別離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。現(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:l紫外檢測器紫外檢測器 2熒光檢測器熒光檢測器 (3) 示差折光率檢測器示差折光率檢測器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同

8、的折射率，幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達靈敏度可達10-7gcm-3。主要缺點是對溫度。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器 (5) 附屬系統(tǒng)附屬系統(tǒng) 它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置要的附屬裝置 . 固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，

9、可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅外表鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為外表多孔型和全多孔型固定相兩類。 它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。外表活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以

10、及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；外表活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；為聚酰胺的，如Pellion。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。 它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的Lichrosorb ALOXT。這類固定相由于顆粒很細510m，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率

11、快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物別離及痕量分析. 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的別離度。對流動相溶劑的要求是： 1溶劑對于待測樣品，必須具有適宜的極性和良好的選擇性。 2溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差異的溶劑作流動相，以達最高

12、靈敏度。3高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50IOOnm。4化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反響或聚合的溶劑。(5)低粘度。假設(shè)使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于別離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響別離. 液一液分配色譜法LLPC 在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的別離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1別離原理 液液分配色譜的別離

13、原理根本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)屢次進行，造成各組分的差速遷移，提高了別離效率，從而能別離各種復(fù)雜組分。 2固定相 由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決別離問題。例如，最常用的強極性固定液，一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學(xué)反響鍵合到載體外表的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速開展起

14、著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的別離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進行的。詳細介紹見后。 3流動相 在液液色譜中為了防止固定液的流失。對流動相的一個根本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差異越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的別離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的別離，其流出順序與正相

15、色譜恰好相反。 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于別離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體外表的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的別離。1鍵合固定相類型 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠外表的硅醇基(Si一OH)與有機分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類1疏水基團 如不同鏈長的烷烴C8和C18。和苯基等2極性基團 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。3離子交換基團 如作為陰離子交換基團的胺基，季鍍鹽； 作為陽離子交換 基團的磺酸等.2鍵合固定相的制備l硅酸酯S

16、i一OR鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反響： Si0HROHSiORH20由于這類鍵合固定相的有機外表是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。2SiC或Si一N共價鍵合固定相 制備反響如下 共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反響不方便；當使用水溶液時，必須限制PH在48范圍內(nèi).OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH23硅烷化SiOSiC鍵合固定相制備反響如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl

17、這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在70以下，PH=28范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛. 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇十、乙睛一水、水和無機鹽的緩沖溶液等。它多用于別離多環(huán)芳烴等低極性化合物；假設(shè)采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動相，也可用于別離極性化合物；假設(shè)采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，那么可別離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。 關(guān)于反相鍵合相色譜的別離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相

18、看作一層鍵合在硅膠外表上的十八烷基的“分子毛，這種“分子毛有較強的流水特性。當用極性溶劑為流動相來別離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性局部與固定相外表上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保存在固定相中；而另一方面，被別離物的極性局部受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保存作用見圖20-4。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保存行為。 此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠外表，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑如烴類中參加適量的極性溶劑如氯仿、醇、乙臘等為流動相，別離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加

19、而降低。 這種色譜方法主要用于別離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于別離不同類型的化合物。 當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2NCH3等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其別離原理與離子交換色譜類同。 以上討論了各種類型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地別離各種類型化合物非極性、極性和離子型。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有8O的別離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點是不能用于酸

20、、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類來選擇化學(xué)鍵合的固定相，請參看表20-3。 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的外表存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行別離的。1別離原理 當流動相通過固定相吸附劑時，吸附劑外表的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子X被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保存就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟糜谑牵诠潭ㄏ嗤獗戆l(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS達平衡時,有 nadnadadSXSXK其中Kad為吸附平衡常數(shù)，

21、值大表示組分在吸附劑上保存強，難于洗脫。Kad值小,那么保存值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以別離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反響等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，外表多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但外表多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。 一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫

22、劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)0來衡量。0越大，表示洗脫劑的極性越強。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的0值。在硅膠吸附劑中0值的順序相同，數(shù)值可換算0硅膠=0770氧化鋁。 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種別離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行別離。它不僅適用無機離子混合物的別離，亦可用于有機物的別離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 1離子交換原理 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差異來實現(xiàn)別離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂

23、上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反響通式如下：陽離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+陰離子交換： RNR3+Cl-+ X-RNR3+X-+ Cl-一般形式： R一AB RBA 式中Ar，Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子A和試樣離子B的濃度，A、B那么代表它們在溶液中的濃度。離子交換反響的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對于A型樹脂親和力的大小：KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保存而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。rrABABABK/對于典型的磺酸型陽

24、離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價離子的順序為： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂聚苯乙烯、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分見表20-5 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： l多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和

25、二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分見圖20-6中a和b。2薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約對30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層，如圖20-6中c。3外表多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂，如圖20-6中d所示。4離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反響將離子交換基團鍵合到惰性載體外表。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速別離。 離子交換色譜法所用流動相大

26、都是一定pH和鹽濃度或離子強度的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，那么可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保存值。 一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 但差異不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如

27、，別離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保存增大。 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種別離方法。由于離子交換色譜法在無機離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導(dǎo)檢測器，由于被測離子的電導(dǎo)信號被強電解質(zhì)流動相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法檢測。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術(shù)。他們在離子交換別離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與別離柱電荷相反的離子交

28、換樹脂。通過別離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。假設(shè)樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的別離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反響：R+OHH+Cl- -R+Cl十H2OR+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反響可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的26倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離

29、子樣品也有相似的作用機理。 在別離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了別離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。 離子對色譜法是別離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。它是離子對革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀7O年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的開展。1離子對色譜法原理 離子對色譜法是將一種或數(shù)種與溶質(zhì)離

30、子電荷相反的離子稱對離子或反離子加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保存行為的一種色譜法。關(guān)于離子對色譜機理，至今仍不十清楚確，已提出三種機理：離子對形成機理；離子交換機理；離子相互作用機理?，F(xiàn)以離子對形成機理說明之。假設(shè)有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其中參加一種電荷與組別離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負電的人組別離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反響式 由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相有機相提取。組別離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致

31、各組別離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法別離的根本原理。KABA-水相 +A-B+有機相B+有機相2鍵合相反相離子對色譜法 離子對色譜法類型很多，根據(jù)流動相和固定相的極性可分為反相離子對和正相離于對色譜法。其中以鍵合相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相ODS等，流動相為加有平衡離子反離子的極性溶液如甲醇一水或乙睛一水。 根據(jù)離子對生成反響式，平衡常數(shù) KAB可表示為水相水相有機相BABAKAB 根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù) 水相水相有機相BKABAKAB式中為相比率。容量因子k隨KAB和B+水相的增大而增大。 鍵合相反相離子對

32、色譜法操作簡便，只要改變流動相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變別離的選擇性，能較好解決難別離混合物的別離問題。此法開展迅速，應(yīng)用較廣泛.1水相BKVVKkABMS 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的別離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)別離的。 尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：1保存時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保存時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器3固定相與分子間作用力

33、極弱，趨于零。由于柱子不能很強保存分子，因此柱壽命長。4不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差異必須大于10才能得以別離。1別離原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行別離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子局部滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子根本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。 2固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。表20-6列出了常用的一些固定相。 所謂凝膠，指含有大量液體一般是水的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 1軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 2半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯Styragel比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。 3剛性凝膠 如多孔