微生物分類鑒定

1、第三節(jié) 微生物的分類鑒定方法 一、微生物鑒定的依據(jù) 獲得純化的微生物分離菌株后，首先判定是原核微生物還是真核微生物，這實(shí)際上在分離過程中所使用的方法和選擇性培養(yǎng)基已經(jīng)決定了分離菌株的大類的歸屬，從平板菌落的特征和液體培養(yǎng)的性狀都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根據(jù)表 14-3 所示的經(jīng)典分類鑒定指標(biāo)進(jìn)行鑒定，如條件允許，可做碳源利用的 BIOLOG-GN 分析和 16S rDNA 序列分析。多項(xiàng)結(jié)果結(jié)合起來確定分離菌株的屬和種。 表 14-3 微生物經(jīng)典分類鑒定方法的指標(biāo)依據(jù) 經(jīng) 典 分 類 法 個(gè)體：細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式，染色反應(yīng)，有無運(yùn)動(dòng)，各種特殊構(gòu)造特征等 形態(tài)特征：菌落形態(tài)，

2、在固體、半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等 營養(yǎng)要求：碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長因子等 生理生化特征：代謝產(chǎn)物種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等 酶：產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特征等 生態(tài)學(xué)特性：生長溫度，對(duì)氧的需要，酸堿度要求，宿主種類，生態(tài)分布等 血清學(xué)反應(yīng) 噬菌體的敏感性 其他 二、微生物鑒定的技術(shù)與方法 根據(jù)目前微生物分類學(xué)中使用的技術(shù)和方法，可把它們分成四個(gè)不同的水平：細(xì)胞形態(tài)和行為水平，細(xì)胞組分水平，蛋白質(zhì)水平，基因組水平； 在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類鑒定指標(biāo)是以在細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性為主，可稱為經(jīng)典的分類鑒定法。其他三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要是 60 年代以后采用的，稱為化學(xué)分類和遺傳學(xué)分類法，這些方法再加上數(shù)

3、值分類鑒定法，可稱為現(xiàn)代的分類鑒定方法。 （一）、經(jīng)典分類鑒定法 經(jīng)典分類法是一百多年來進(jìn)行微生物分類的傳統(tǒng)方法。其特點(diǎn)是人為地選擇幾種形態(tài)生理生化特征進(jìn)行分類，并在分類中將表型特征分為主、次。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。最后，采用雙歧法整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，排列一個(gè)個(gè)的分類單元，形成雙歧檢索表（圖 14-4 ）。 A. 能在 60 o C 以上生長 B. 細(xì)胞大，寬度 1.31.8mm 1. 熱微菌屬 ( Thermomicrobium ) BB. 細(xì)胞小，寬度 0.40.8mm C. 能以葡萄糖為碳源生長 D. 能在 pH4.5 生長 2. 熱酸菌

4、屬 ( Acidothermus ) DD. 不能在 pH4.5 生長 3. 棲熱菌屬 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖為唯一碳源 4. 棲熱嗜油菌屬 ( 棲熱嗜獅菌屬 Thermoleophilum ) AA. 不能在 60 o C 以上生長 圖 14-4 雙歧法檢索表例樣 應(yīng)用 BIOLOG-GN 儀檢測分離菌株對(duì)眾多碳源的利用情況判斷分離菌株的分類地位，近年來也時(shí)有應(yīng)用。在 BIOLOG-GN 儀上有 96 個(gè)小孔，其中 95 孔內(nèi)分裝有 95 種不同碳源的緩沖液， 1 孔為無碳源的緩沖液對(duì)照，各孔接入適宜菌濃度和液量的分離菌株培養(yǎng)物，定溫培養(yǎng)，每日定時(shí)讀取 BIOLOG-G

5、N 儀計(jì)算機(jī)上各碳源利用情況，一般為時(shí) 1 周， BIOLOG-GN 儀可顯示出該鑒定菌株的最可能歸屬。 （二）、數(shù)值分類法 又稱阿德遜氏分類法 () 。它的特點(diǎn)是根據(jù)較多的特征進(jìn)行分類，一般為 50 60 個(gè)，多者可達(dá) 100 個(gè)以上，在分類上，每一個(gè)特性的地位都是均等重要。通常是以形態(tài)、生理生化特征，對(duì)環(huán)境的反應(yīng)和忍受性以及生態(tài)特性為依據(jù)。最后，將所測菌株兩兩進(jìn)行比較，并借用電子計(jì)算機(jī)計(jì)算出菌株間的總相似值，列出相似值矩陣 ( 圖 14-5) 。為便于觀察，應(yīng)將矩陣重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹狀譜 (dendrogram)( 圖 14-6) ，再結(jié)合主觀上的判斷

6、 ( 如劃分類似程度大于 85 者為同種，大于 65 者為同屬等 ) ，排列出個(gè)個(gè)分類群。 圖 14-5 顯示 6 個(gè)細(xì)菌菌株的遺傳相似矩陣圖 圖 14-6 根據(jù)相似矩陣圖轉(zhuǎn)換的相似關(guān)系樹狀譜 數(shù)值分類法的優(yōu)越性在于它是以分析大量分類特征為基礎(chǔ)，對(duì)于類群的劃分比較客觀和穩(wěn)定；而且促進(jìn)對(duì)細(xì)菌類群的全面考查和觀察，為細(xì)菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數(shù)值分類法對(duì)細(xì)菌菌株分群歸類定種或定屬時(shí)，還應(yīng)做有關(guān)菌株的 DNA 堿基的 G + Cmol% 和 DNA 雜交，以進(jìn)一步加以確證。 （ 三）、化學(xué)分類法 微生物分類中，根據(jù)微生物細(xì)胞的特征性化學(xué)組分對(duì)微生物進(jìn)行分類的方法稱化學(xué)分類法 (chemot

7、axonomy) 。在近二十多年中，采用化學(xué)和物理技術(shù)采研究細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組成，已獲得很有價(jià)值的分類和鑒定資料，各種化學(xué)組分在原核微生物分類中的意義見表 14-4 。 表 14-4 細(xì)菌的化學(xué)組分分析及其在分類水平上的應(yīng)用 細(xì)胞成份 分析內(nèi)容 在分類水平上的作用 細(xì)胞壁 肽聚糖結(jié)構(gòu) 種和屬 多糖 胞壁酸 膜 脂肪酸 種和屬 極性類脂 霉菌酸 類異戊二烯苯醌 蛋白質(zhì) 氨基酸序列分析 屬和屬以上單位 血清學(xué)比較 電泳圖 酶譜 代謝產(chǎn)物 脂肪酸 種和屬 全細(xì)胞成分分析 熱解氣液色譜分析 種和亞種 熱解 質(zhì)譜分析 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞化學(xué)組分分析用于微生物分類日趨顯示出重要性。細(xì)胞壁的氨基酸種類

8、和數(shù)量現(xiàn)己被接受為細(xì)菌屬的水平的重要分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。在放線菌分類中，細(xì)胞壁成分和細(xì)胞特征性糖的分析作為分屬的依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)是區(qū)別細(xì)菌還是古菌的標(biāo)準(zhǔn)之一，細(xì)菌具有?；?( 脂鍵 ) ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區(qū)分古菌。霉菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規(guī)方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細(xì)胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細(xì)菌的一個(gè)重要標(biāo)志。此外某些細(xì)菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌，細(xì)胞色素，以及紅外光譜等分析對(duì)于細(xì)菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價(jià)值。 （四）、遺傳學(xué)分類法 分子遺傳學(xué)分類法是以微生物的遺傳型 ( 基因型 ) 特征為依

9、據(jù)，判斷微生物問的親緣關(guān)系，排列出一個(gè)個(gè)的分類群。目前較常使用的方法有： 1 、 DNA 中 G+C mol% 分析 每一個(gè)微生物種的 DNA 中 GC mol% 的數(shù)值是恒定的，不會(huì)隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個(gè)屬不同種之間， DNA 中 GCmol% 的數(shù)值不會(huì)差異太大，可以某個(gè)數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GC mol% 范圍。 DNA 中 GC mol% 分析主要用于區(qū)分細(xì)菌的屬和種，因?yàn)榧?xì)菌 DNA 中 GC 含量的變化范圍一般在 25 75 ；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 (37 51%) 。一般認(rèn)為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別

10、超過了 10 ，這兩種微生物就肯定不是同一個(gè)種。因此可利用 G+C mol 來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其 G+C mol 含量相同或者近似，但 G+C mol 相同或近似的細(xì)菌，其親緣關(guān)系并不一定相似，這是因?yàn)檫@一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對(duì)的排列序列，而且如放線菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 51 之間，企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個(gè)屬顯然是不現(xiàn)實(shí)的。要比較兩種細(xì)菌的 DNA 堿基對(duì)排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗(yàn)。 2 、 DNA-DNA 雜交 DNA 雜交法的基本原理是用 DNA 解鏈的可逆性和堿基

11、配對(duì)的專一性，將不同來源的 DNA 在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)結(jié)合成雙鏈 DNA ，然后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分?jǐn)?shù)。如果兩條單鏈 DNA 的堿基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為 100% 。如果兩條單鏈 DNA 的堿基序列只有部分相同，則它們能生成的“雙鏈”僅含有局部單鏈，其雜合率小于 100% 。由此；雜合率越高，表示兩個(gè) DNA 之間堿基序列的相似性越高，它們之間的親緣關(guān)系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的 DNA 雜合率可高達(dá) 100 ，而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的 DNA 雜合率較低，約有 70 。 G+Cmol 的測定和 DNA 雜交實(shí)

12、驗(yàn)為細(xì)菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特征為依據(jù)所無法解決的一些疑難問題，但對(duì)于許多屬以上分類單元間的親緣關(guān)系及細(xì)菌的進(jìn)化問題仍不能解決。 3 、 DNA rRNA 雜交 目前研究 RNA 堿基序列的方法有兩種。一是 DNA 與 rRNA 雜交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 與 rRNA 雜交的基本原理、實(shí)驗(yàn)方法同 DNA 雜交一樣，不同的是 是 DNA 雜交中同位素標(biāo)記的部分是 DNA ，而 DNA 與 rRNA 雜交中同位素標(biāo)記的部分是 rRNA 。 DNA 雜交結(jié)果用同源性百分?jǐn)?shù)表示，而 DNA 與 rRNA 雜交結(jié)果用 Tm(e) 和 RNA 結(jié)合

13、數(shù)表示。 Tm(e) 值是 DNA 與 rRNA 雜交物解鏈一半時(shí)所需要的溫度。 RNA 結(jié)合數(shù)是 100 m gDNA 所結(jié)合的 rRNA 的 m g 數(shù)。根據(jù)這個(gè)參數(shù)可以作出 RNA 相似性圖。在 rRNA 相似性圖上，關(guān)系較近的菌就集中到一起。關(guān)系較遠(yuǎn)的菌在圖上占據(jù)不同的位置。用 rRNA 同性試驗(yàn)和 16SrRNA 寡核苷酸編目的相似性比較 rRNA 順反子的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得到屬以上細(xì)菌分類單元的較一致的系統(tǒng)發(fā)育概念，并導(dǎo)致了古細(xì)菌的建立。 4 、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析 首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRN

14、A ）中。 rRNA 參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時(shí)間鐘。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。第三， 16S rRNA 的相對(duì)分子量大小適中，約 1 540 個(gè)核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作為測量各類生物進(jìn)化和親緣關(guān)系的良好工具。 分離菌株 16S rRNA 基因的分離較為簡單。從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細(xì)胞 , 加入 100L 無菌重蒸 H 2 O 中 , 旋渦混勻后 , 沸水浴 2min, 1

15、2 000r min -1 離心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 擴(kuò)增。分離菌株 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增和序列測定的一般步驟為： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。擴(kuò)增反應(yīng)體積 50 m L ，反應(yīng)條件為 95 預(yù)變性 5min ， 94 變性 1min ， 55 退火 1min ， 72 延伸 2min ，共進(jìn)行 29 個(gè)循環(huán)， PCR 反應(yīng)在 PTC-200 型熱循環(huán)儀上進(jìn)

16、行。取 5 m L 反應(yīng)液在 10g L -1 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。 PCR 產(chǎn)物測序可由專門技術(shù)公司完成。 測序得到 分離菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用寫字板或 Editsequence 軟件打開，將所得序列通過 Blast 程序與 GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析 ( /blast ) ，具體步驟如下：點(diǎn)擊網(wǎng)站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST blastn 選項(xiàng)，將測序所得序列粘貼在“ search ”網(wǎng)頁空白處

17、，或輸入測序結(jié)果所在文件夾目錄，點(diǎn)擊核酸比對(duì)選項(xiàng)，即“ blast ”，然后點(diǎn)擊“ format ”，計(jì)算機(jī)自動(dòng)開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進(jìn)行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)伲约熬晗嚓P(guān)信息，從而初步判斷 16S rDNA 鑒定結(jié)果。 遺傳距離矩陣與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可采用 DNAStar 軟件包中的 MegAlign 程序計(jì)算樣本間的遺傳距離。由 GenBank 中得到相關(guān)菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入 Clustalx1.8 程序進(jìn)行 DNA 同源序列排列，并經(jīng)人工仔細(xì)核查。在此基礎(chǔ)上，序列輸入 Phylip3.6 軟件包，以簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用

18、Kimura 2-parameter 法，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法（ Bootstrap ） 500 次重復(fù)檢測， DNA 序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。 第一章微生物檢驗(yàn)常規(guī)鑒定技術(shù) 課 堂 教 學(xué) 計(jì) 劃（1學(xué)時(shí)）名 稱第一章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)目 的要 求復(fù)習(xí)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)，并重點(diǎn)掌握微生物常規(guī)鑒定技術(shù)；如形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察以及微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)。重 點(diǎn)難 點(diǎn)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)教 學(xué) 內(nèi) 容 及 教 學(xué) 組 織教學(xué)方法、手段及時(shí)間安排第一章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、接種二、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)三、培養(yǎng)二一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染

19、色2、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落二、生理生化試驗(yàn)微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)通過講授和演示等方式進(jìn)行；并采取舉例方式進(jìn)行教學(xué)，使其理論與實(shí)踐相結(jié)合，便于理解記憶。第一章微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)包括顯微鏡、染色技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)等。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。、接種工具和方法接種和分離工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的

20、作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。）三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線周圍能夠生長。）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，

21、迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個(gè)的微生物菌落。）涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個(gè)的微生物的菌落。）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。）活體接種 活體接種是專門用

22、于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。圖5斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一

23、個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖5，a）圖5傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無菌水、涂布平板法首

24、先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。（圖5，b）、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖5）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。（圖5）、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條

25、件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖5平板劃線分離法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更

26、有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。三、培養(yǎng)1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，

27、加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d.替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)： 第二章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過

28、染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、

29、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。（圖）圖細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點(diǎn)狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規(guī)則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.波狀 14.裂片狀 15.嚙蝕狀 16.絲狀 17.卷發(fā)狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展?fàn)?22.樹根狀 23.假根狀 24.絲狀 25.串珠狀 26.乳頭狀 27.絨毛狀 28.樹根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏斗狀 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環(huán)狀 36.蹼

30、狀 37.膜狀）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是

31、微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：、糖酵解試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵

32、能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。、淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗(yàn)方法：以1824h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養(yǎng)2448h，或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉

33、湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。、V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。試驗(yàn)方法：）OMeara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加OMeara試劑（加有0.3%

34、肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管12min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?850°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。）Barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°C萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)25min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性

35、。）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。、甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗(yàn)方法：挑

36、取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）35天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑12滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.46.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。、靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)

37、二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝

38、酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。、明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種

39、于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于2022培養(yǎng)714天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽性，1020min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。、尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體

40、培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑12滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。10、硫化氫（H2S）試驗(yàn)有

41、些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1培養(yǎng)2428h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1培養(yǎng)16天。紙條變黑為陽性。11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)

42、生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對(duì)照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩

43、選功效。三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。、凝集