實(shí)驗(yàn)四、基因組DNA的提取和檢測(cè)(陽(yáng)成偉)

1、實(shí)驗(yàn)四、基因組實(shí)驗(yàn)四、基因組DNA的提取的提取準(zhǔn)備：一次性手套、 65水浴鍋、氯仿、無(wú)水乙醇、1.5離心管、菜花實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?.了解真核生物基因組DNA提取的一般原理。2.了解基因組DNA的實(shí)驗(yàn)用途。3. 掌握基因組DNA提取的方法和步驟。 材料：材料：花椰菜花椰菜/昆蟲(chóng)組織昆蟲(chóng)組織 設(shè)備：設(shè)備：移液器，高速離心機(jī)，移液器，高速離心機(jī)，水浴鍋，水浴鍋，培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 。 試劑：試劑：1. CTAB組織消化液組織消化液2. 氯仿3. 無(wú)水乙醇4. TE緩沖液CTAB溶液配制 2%CTAB溶液：100mmol/L Tris-HCl, pH7.0；1.4mol/L NaCl；20mmol/L

2、EDTA；2%CTAB. 10 mlfinal conc.（終濃度）（終濃度）CTAB0.2 g2%H2O5.78 ml 1 M Tris-HCl1.0 ml100 mM5 M NaCl2.8 ml1.4 M0.5 M EDTA0.4 ml20 mM實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（CTAB法）法） CTAB，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，可使細(xì)胞破裂，釋放出核酸； CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解釋放出來(lái)的DNA （ DNA在2mol/LNaCl中DNA具有較高的溶解度）； 加入無(wú)水乙醇，可以使DNA從溶液中沉淀出來(lái)。實(shí)驗(yàn)步驟（常溫操作，實(shí)驗(yàn)步驟（常溫操作，2人一組）人一

3、組）1.取適量(300-500mg)植物組織，加入2ml CTAB抽提緩沖液，充分勻漿2-3min，然后每人每人轉(zhuǎn)移700ul的勻漿液至一支1.5ml離心管中，65水浴水浴45min（中間搖動(dòng)（中間搖動(dòng)2-3次）次）（裂解細(xì)胞，釋放核酸和蛋白）；2.加入700ul的氯仿，上下?lián)u動(dòng)2-3min (此步是萃取組織液中的蛋白質(zhì)；務(wù)必帶上手套！務(wù)必帶上手套?。?；3. 12000rpm離心10min，取400ul上清液轉(zhuǎn)移至一支1.5ml離心管中（由于此時(shí)懸液已經(jīng)分層，而我們需要取最上層的溶液，所以注意千萬(wàn)不要使槍頭觸碰到中間的雜質(zhì)層，當(dāng)然，更不能取吸取下層的萃取液了）；4.加入1/10體積的NaAc(

4、3mol/L,pH5.2）（40ul），上下顛倒3-4次混勻；然后再加入2倍體積的無(wú)水乙醇（0.9ml)，上下顛倒3-4次混勻（如DNA量大，此時(shí)可見(jiàn)絮狀DNA沉淀。（如果放置于-20度過(guò)夜，DNA產(chǎn)率會(huì)更多?。?. 12000rpm離心5min，緩緩倒掉上清液（剩余的液體可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（無(wú)色透明膠狀物！）；6. 加入200ulTE緩沖液（含50ug/ml RNase），輕輕彈管底，以彈管底，以溶解溶解DNA；也可以用槍頭緩慢地來(lái)回吸放液體來(lái)幫助溶解；也可以用槍頭緩慢地來(lái)回吸放液體來(lái)幫助溶解DNA。此時(shí)應(yīng)該可以看到片狀的。此時(shí)應(yīng)該可以看到片狀的DNA沉淀物逐漸變少，最沉

5、淀物逐漸變少，最終消失終消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否則影響電泳效果?。?. 將DNA溶液置于37 培養(yǎng)箱或水浴中30min（降解殘留的RNA） ；8. -20 保存?zhèn)溆谩?. 取510ulDNA（加適量loading buffer）電泳檢測(cè)；取2ulDNA測(cè)定濃度和OD260/280（下次課電泳檢測(cè)）。基因組基因組DNA的檢驗(yàn)（純度）的檢驗(yàn)（純度）紫外分光光度法：紫外分光光度法：核酸在260nm處有最大吸收峰蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰1.7OD260/OD2802.0基因組基因組DNA的檢驗(yàn)（完整性）的檢驗(yàn)（完整性）凝膠電泳法：凝膠電泳

6、法： 基因組基因組DNADNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 123456材料質(zhì)量（mg）100300500100300500所加TE體積（ul）200200200400400400260/2802.031.971.922.072.022.01260/2302.102.312.192.051.952.02濃度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0上樣2ul上樣8ul注：1-6序號(hào)分別與表中對(duì)應(yīng)。核酸的貯存DNA保存

7、1 1）短期貯存：）短期貯存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（TrisTris和和EDTAEDTA）緩沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖緩沖液液(PH(PH為為8 8.0).0)，可減少可減少DNADNA脫氨脫氨反應(yīng)；反應(yīng)；EDTAEDTA可可以抑制以抑制DNaseDNase的活性。的活性。2 2）長(zhǎng)期貯存：）長(zhǎng)期貯存： TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年保存數(shù)年；無(wú)水乙醇沉淀無(wú)水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是等鹽離子，作用是中和核酸分子表面中和核酸分子表面的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚集的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚集。 無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使無(wú)水乙