傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)_氨基丁酸乳酸菌的篩選

1、中國(guó)乳品工業(yè)CHINA dairy INDUSTRY傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)氨基丁酸乳酸菌的篩選冀林立，方芳，魏小雁，張彥斌，孟和畢力格（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特）摘要：采用薄層層析法和高效液相色譜法，對(duì)分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌進(jìn)行了氨基丁酸生成能力的分析。薄層層析結(jié)果顯示，在質(zhì)量濃度為的谷氨酸鈉（）的液體培養(yǎng)基中，株乳酸菌中有株菌可生成氨基丁酸；通過(guò)高效液相色譜法定量分析，獲得株生成量較高的菌株，分別為（）、（）、（）、（）、（），（）、（）、（）和（）。該項(xiàng)研究為富含氨基丁酸功能性乳制品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：乳酸菌；氨基丁酸；薄層層析；高

2、效液相色譜法中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文章編號(hào)：（），（，）：（）（）（），（），（），（），（），（），（），（），（）（），：；引言乳酸菌廣泛分布于自然環(huán)境和各種發(fā)酵食品中，尤其是在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中呈優(yōu)勢(shì)菌群影響著其風(fēng)味和制品的功能性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌具有活性，能促進(jìn)谷氨酸鹽（氨基丁酸（，），是以自由態(tài)形式廣泛存在于原核生物和真核生物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。已研究證明，具有調(diào)節(jié)血壓，抑制動(dòng)脈硬化，改善肝腎功能，活躍腦代謝以及鎮(zhèn)定等作用，。因此，在醫(yī)藥保健制品和功能性食品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。收稿日期：基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古

3、農(nóng)業(yè)大學(xué)博士基金項(xiàng)目（）。作者簡(jiǎn)介：冀林立（），女，碩士研究生，從事乳品微生物方面的研究。通訊作者：孟和畢力格）轉(zhuǎn)化為。利用合成能力較高的乳酸菌開(kāi)發(fā)富含的功能性食品以及醫(yī)藥保健制品成為熱點(diǎn)，。本研究以蒙古族傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌為出發(fā)菌株，篩選了合成能力較高的菌株，旨在為我國(guó)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌資源的應(yīng)用開(kāi)辟一條的新的路子。實(shí)材料驗(yàn)試驗(yàn)菌株：以內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工年第卷第期（總第期）研究報(bào)告程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保藏的株乳酸球菌和株乳桿菌為試驗(yàn)菌株。參考菌株：，性試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、發(fā)育溫度試驗(yàn)、耐酸試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)以及糖類發(fā)酵試驗(yàn)等，從而判定產(chǎn)生菌株的菌屬屬性。

4、，均購(gòu)和自中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心。主要試劑及材料：氨基丁酸（批號(hào)：）；結(jié)果與分析薄層層析結(jié)果分析將各測(cè)試菌株分別接種于質(zhì)量濃度為的谷氨酸鈉（批號(hào)：）。纖維素薄層層析板（××）。的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，將發(fā)酵液離心后，取定量上清液點(diǎn)樣于薄層層析板上展層并顯色。結(jié)果顯示，在株乳酸菌中，有株菌可生成液體培養(yǎng)基：蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，葡萄糖，乙酸鈉，吐溫，檸檬酸三鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，值為；，滅菌備用。部分乳酸菌薄層層析圖譜如圖所示。液體培養(yǎng)基：蛋白胨，酵母膏，葡萄糖，丁二酸鈉，值為；，滅菌備用。方法菌株活化將真空冷凍干燥保藏的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，待生

5、長(zhǎng)良好后，重復(fù)上一步驟次，使菌株活力恢復(fù)至正常生長(zhǎng)狀態(tài)。圖圖中，乳酸菌培養(yǎng)液的薄層層析圖譜注：為標(biāo)準(zhǔn)樣；為標(biāo)準(zhǔn)生成菌株的初步篩選取上述培養(yǎng)的培養(yǎng)液，按體積分?jǐn)?shù)為接種樣；為；為；為；為；為；為；為；為；為。高效液相色譜結(jié)果分析量接種于質(zhì)量濃度為的谷氨酸鈉（）的液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)。取發(fā)酵液，離心（，），經(jīng)薄層層析分析。薄層層析法，：微量進(jìn)樣器取上清液點(diǎn)樣，點(diǎn)樣線距邊緣，樣品間距，展開(kāi)劑為正丁醇冰醋酸水（體積比），展開(kāi)劑中含有質(zhì)量濃度為的茚三酮。當(dāng)展開(kāi)劑距層析板前沿左右時(shí)將層析板取出顯色，顯色條件：，。表乳酸菌發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度（，±）菌株號(hào)）質(zhì)量濃度（和分別配成質(zhì)量濃度為作為對(duì)照。高

6、效液相色譜法測(cè)定的濃度將的培養(yǎng)液用的稀釋適當(dāng)倍數(shù)，經(jīng)濾膜過(guò)濾后待用。液相色譜儀（）裝有色譜柱（，×），熒光檢測(cè)器。色譜條件：流動(dòng)相（濃度為磷酸鹽緩沖溶液，）和流動(dòng)相（甲醇乙腈水），梯度洗脫，流速為；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)，；柱溫為；進(jìn)樣量為。配制濃度為的溶液，并稀釋至，。條件與樣品相同。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。生成菌株的生物學(xué)特性參照文獻(xiàn)，和中方法，分別進(jìn)行乳酸旋光，（）研究報(bào)告經(jīng)薄層層析分析后選取的株菌均設(shè)個(gè)平行樣品，通過(guò)檢測(cè)。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度為的的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，發(fā)酵液中質(zhì)量濃度最高的是，可達(dá)；的質(zhì)量濃度在有株；在有株。各菌株發(fā)酵液樣品中質(zhì)量濃度如表所示；標(biāo)

7、樣的圖譜如圖所示；菌株發(fā)酵液樣品的圖譜如圖所示。表中，差異顯著性經(jīng)方差分析法檢驗(yàn)，不同大寫(xiě)字母表示在水平上差異顯著，不同小寫(xiě)字母表示在水平上差異顯著。圖標(biāo)樣的高效液相色譜圖菌株生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果分析對(duì)株較高產(chǎn)菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，表為乳酸球菌生物學(xué)性狀的分析結(jié)果。由表可表菌株乳酸菌旋光性葡萄糖產(chǎn)氣生成的乳酸球菌生理生化及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)馬尿酸鹽分解七葉苷水解精氨酸產(chǎn)氨阿拉伯糖木糖鼠李糖核糖葡萄糖甘露糖果糖半乳糖蔗糖麥芽糖纖維二糖乳糖蕈糖密二糖棉籽糖松三糖淀粉菊粉甘露醇肌醇七葉苷水楊苷?qǐng)D發(fā)酵液的高效液相色譜圖以看出，株乳酸球菌均能從葡萄糖生成乳酸，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，在

8、生長(zhǎng)良好，不生長(zhǎng)，不能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的和值為瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此，將，等株菌確定為。其中，和均在值為生長(zhǎng)，可發(fā)酵乳糖、半乳糖、麥芽糖和核糖，不發(fā)酵棉子糖和松三糖，與的生物學(xué)特性基本相符；乳可發(fā)酵棉子糖、半乳糖、糖、麥芽糖，不發(fā)酵松三糖，與的生物學(xué)特性基本相符。表為乳酸桿菌生物學(xué)性狀的分析結(jié)果。由表可以看出，和均能從葡萄糖生成乳酸，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，細(xì)胞壁中含有，在生長(zhǎng)良好，不生長(zhǎng)，可發(fā)酵核糖、甘露糖、山梨醇、葡萄糖酸鹽，不發(fā)酵阿拉伯糖、木糖，符合的特征；能從葡萄糖生成乳酸，在生長(zhǎng)較弱，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞壁中不含有，可發(fā)酵葡萄糖、果糖和蔗糖，不發(fā)酵葡萄糖酸鹽和甘露糖，與的生物學(xué)特性基本相符。年第卷第

9、期（總第期）研究報(bào)告表菌株編號(hào)乳酸菌旋光性葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)生成的乳酸桿菌生理生化及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果的濃度為，培養(yǎng)后，的產(chǎn)量為；當(dāng)培養(yǎng)基中添加磷酸吡哆醛時(shí)，最大可利用濃度增大到，培養(yǎng)后，的產(chǎn)量達(dá)。本試驗(yàn)從幾千年食用的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中也篩選到了較高產(chǎn)的乳酸菌株，度為時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基中的濃未對(duì)其添加磷酸吡哆醛，生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)細(xì)胞壁阿拉伯糖木糖鼠李糖核糖葡萄糖甘露糖果糖半乳糖蔗糖麥芽糖纖維二糖乳糖蕈糖密二糖棉籽糖松三糖淀粉甘露醇山梨醇葡萄糖酸鈉七葉苷水楊苷培養(yǎng)后，發(fā)酵液中質(zhì)量濃度已達(dá)，其余株菌，和發(fā)酵液中分別為，和。乳酸菌生成的能力與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系，。研究表明，是乳酸菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在菌體生長(zhǎng)后期

10、積累量增加，可見(jiàn)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)其次培養(yǎng)基間可提高的生成量。中的質(zhì)量濃度、培養(yǎng)基的起始值以及培養(yǎng)溫度等都對(duì)的生成有很大影響。所以，有望通過(guò)對(duì)該些菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，來(lái)提高的生成量?，F(xiàn)已報(bào)道產(chǎn)生的乳酸菌有乳酸乳球菌，乳酸鏈球菌，短乳桿菌，植物乳桿菌等，。本試驗(yàn)篩選出的討論株菌與報(bào)道菌株的生物學(xué)特性不完全相同，有必要對(duì)其深入研究，以便為我國(guó)傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌資源開(kāi)辟新的路子奠定基礎(chǔ)。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品制作和食用歷史悠久，經(jīng)過(guò)幾千年的世代相傳和自然選擇，其中一些優(yōu)良的微生物資源，特別是乳酸菌保留了下來(lái)。因而，從這些自然發(fā)酵的乳制品中篩選優(yōu)良菌株用于發(fā)酵乳的生產(chǎn)具有一定的優(yōu)勢(shì)。參考文獻(xiàn)：楊勝遠(yuǎn)，陸兆

11、新，呂風(fēng)霞，等，氨基丁酸的生理功能和研究開(kāi)發(fā)進(jìn)展食品科學(xué)，（）：，（），（）：，（）：凌代文乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，由于其很高的生理功能和廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)受到越來(lái)越多的注意和研究。國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同來(lái)源的乳酸菌，如酸菜湯、自制泡菜、谷物、蔬菜中均得到了高產(chǎn)的菌株。例如，夏江等從未滅菌的新鮮牛奶中篩選到了一株短乳桿菌，當(dāng)培養(yǎng)基中濃度加大到時(shí)，培養(yǎng)后，的產(chǎn)量為。等以酒糟為原料，培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)幾乎能將酒糟中的自由谷氨酸全部轉(zhuǎn)化為。上野等從泡菜中篩選到的乳桿菌，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加磷酸吡哆醛時(shí)，最大可利用（下轉(zhuǎn)第頁(yè)），（）研究報(bào)告合，即菌株的產(chǎn)酸性與耐酸性較其余菌株強(qiáng)，隨著活菌數(shù)的增

12、加，酸奶的酸度增加，其風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰與乙醛的含量均下降。業(yè)，（）：王丹，劉鵬酸奶中乙醛含量測(cè)定方法的初步探討中國(guó)乳品工業(yè)，（）：，？，：，：趙剛，王大泉，李建清益生菌應(yīng)用于菌群調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)的現(xiàn)狀研究中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，（）：結(jié)論本研究比較了添加不同益生菌的酸奶，在常溫波動(dòng)儲(chǔ)存期間的滴定酸度、益生菌活菌數(shù)、雙乙酰含量和乙醛含量，通過(guò)相關(guān)性分析，不同的酸奶各指標(biāo)間相關(guān)程度有明顯差異，表明不同的益生菌都具有各自不同的生長(zhǎng)和代謝特性；另外，儲(chǔ)藏溫度對(duì)酸奶產(chǎn)品的風(fēng)味有很大的影響，酸奶產(chǎn)品脫冷將對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。，（），（）：，：乳酸菌飲料風(fēng)味及其部分理化特性的研究梅林，王志耕酸奶、乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，（）：參考文獻(xiàn)：，（）：楊月欣益生菌的功能營(yíng)養(yǎng)健康新觀察，（）：金蘇酸奶益生菌的最佳食物載體食品工業(yè)，（）：楊潔彬乳酸菌生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，：（），：劉鵬，王丹酸奶中聯(lián)乙酰含量測(cè)定方法的初步探討中國(guó)乳品工郭本恒現(xiàn)代乳品技工技術(shù)叢書(shū)酸奶北京：化學(xué)工業(yè)出版社，（）：，（上接第頁(yè)），：氨基丁酸乳酸菌的篩選蔣冬花，后加衡，黃大年