熒光定量PCR法道理匯總

1、我們前面比較詳細(xì)地介紹了熒光染料法做定量PCR的有關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品，顯然，作為定量 PCR的初期階段的熒光染料法還是有局限性的，比如，由于染料不能區(qū)分特異性 PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法；需要在PCR后進(jìn)行熔鏈曲線分析；也不能做多重PCR檢測（ Multiplex）。上個世紀(jì) 90年代原美國 Perkin Elmer( PE) 公司開發(fā)出了 Taqman熒光探針定量技術(shù)，將定量 PCR帶入了更廣闊的應(yīng)用空間。 Taqman探針法的出現(xiàn)是定量PCR技術(shù)的重要里程碑，之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法，是對探針法的不斷改

2、進(jìn)和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術(shù)的研究人員就不能錯過這些定量檢測技術(shù)。要提到熒光探針或者熒光引物，有一個基礎(chǔ)概念需要首先明確，那就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一對合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個能量供體(donor)和能量受體 (acceptor)對,其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當(dāng)它們在空間上相互接近到一定距離 (1 10 nm) 時，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供

3、體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等有關(guān)。定量 PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個 FRET原理相關(guān)。實(shí)時熒光 PCR中另一個很重要的概念，即 Ct 值.C 代表循環(huán) (Cycle) ， T 代表閾值 (Threshold).Ct 值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) . 。一般取 PCR反應(yīng)的前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍。研究表明，每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

4、因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。一：水解探針法TaqMan技術(shù)原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補(bǔ)的基因特異性探針（通常 20 30bp ），探針上 5' 端和 3' 端分別標(biāo)記了一個報告熒光基團(tuán)（供體）和一個淬滅熒光基團(tuán)（受體） ，在反應(yīng)初始（探針完整）時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當(dāng) PCR 過程中 Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模版的位點(diǎn)時，其 5'-3' 核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針 5' 端的報告基

5、團(tuán) 游離的報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就對應(yīng)有一個游離的熒光分子（報告基團(tuán)）形成，保證了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，因此對熒光信號進(jìn)行檢測就可以實(shí)時監(jiān)控 PCR 的過程，準(zhǔn)確定量 PCR 的起始拷貝數(shù)。但是實(shí)際上探針較長使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會產(chǎn)生不同波長的熒光，都會使得本底偏高 .MGB 原理：針對 Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000 年美國技術(shù)司推出了一種新 TaqMan探針 MGB 探針（ minorgrooveABI 公binder

6、oligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3' 端采用了非熒光性的淬滅基因 淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB 探針的 3' 端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉 - 三肽 ( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交 ,升高探針 Tm值,使較短的探針同樣能達(dá)到較高的 Tm 值 而短探針的熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近 , 淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高：一個 15bp 的 MGB 探針的信噪比大于 6, 優(yōu)于理想狀態(tài)下的

7、25bp 的普通 Taqman 探針（信噪比約為1.5 ）。允許采用更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本。有實(shí)驗(yàn)證明MGB 探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變( 因?yàn)閴A基錯配對較短探針的雜交穩(wěn)定性影響更大)水解探針之所以稱之為水解，主要是因?yàn)樗玫氖荰aq 酶的水解作用，使得探針上的熒光報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)光信號，游離的報告基團(tuán)數(shù)目對應(yīng)PCR新擴(kuò)增產(chǎn)物，此方法檢測的是積累熒光。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，特異性高：具有模版序列特異的 Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高的定量 PCR的專一性；每擴(kuò)增一個特異產(chǎn)物只釋放一個分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對檢

8、測信號沒有影響，有效提高檢測的專一性。有多種不同波長的熒光基團(tuán)對可供選擇，使得 Taqman探針法可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測多重 PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性避免了熒光染料對PCR反應(yīng)的影響缺點(diǎn)：探針設(shè)計有一定難度，需要驗(yàn)證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高此外，也有人認(rèn)為， Taqman法利用了 Taq 酶的外切活性，而由于各家公司出產(chǎn)的 Taq 酶對于其外切酶活性并沒有做出嚴(yán)格的活性標(biāo)定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來了不確定性。至少， 生物通定量 PCR技術(shù)系列前面介紹的 Stratagene 2100 萬美元專利之爭的 Fullvelocity DN

9、A 聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于 Taqman探針法了！應(yīng)用：Taqman技術(shù)廣泛應(yīng)用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動物疾病病原體基因的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測定上等方面都有成功的許多例子。注意：1)探針長度應(yīng)在15-45bp （最佳 20-30bp) 左右，以保證結(jié)合的特異性。2)GC堿基含量在40%-60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3) 避免與引物發(fā)生雜交或重疊。4) 探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度, 因此探針的 Tm值要比引物的 Tm 值至少高出5。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影

10、響。另外，在儀器的選擇上也要注意，盡量選擇具有4色或以上的熒光檢測通道的儀器，已保證你的機(jī)器的適用性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術(shù)是在快速發(fā)展的。二：雜交探針法FRE 原理：羅氏專利的 FRET 探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。FRET 技術(shù)探針由兩條和模版互補(bǔ)、且相鄰的特異探針組成（距離1 5bp ），上游探針的 3 端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，相鄰下游探針的5 端標(biāo)記 Red640 受體熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團(tuán)和 Red640 受體基團(tuán)緊密相鄰（距離 1 5bp ），激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被 Red640 基團(tuán)吸收，使得檢測探頭可以檢測到 Red640

11、 發(fā)出波長為 640 的熒光。當(dāng)變性時，兩探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測到 640 波長的熒光。 FRET 探針檢測的信號是退火時的實(shí)時信號，每次檢測信號始終嚴(yán)格對應(yīng)模版的數(shù)量，非累積信號，可以用于做 Tm 曲線和 SNP 檢測。常用的受體熒光基團(tuán)除了 LC-Red640 還有 LC-Red705 。 兩個單標(biāo)記探針的長短不影響信號的傳遞，而探針間的距離通常為 1-5bp （雖然越短越好，還是要留點(diǎn)空間避免相互之間的反應(yīng)） 。我們前面提到， Taqman水解探針法中，一但報告基團(tuán)水解離開淬滅基團(tuán)，就一直游離于反應(yīng)體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，是不可逆的。雜交探針不同，是復(fù)性時兩條特異

12、探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信號，到升溫變性探針遠(yuǎn)離模版就沒有信號，所以檢測的是實(shí)時信號，是可逆的，所以可以進(jìn)行熔解曲線的分析，還可以用于進(jìn)行突變分析， SNP 基因分型以及產(chǎn)物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點(diǎn)突變，通過熔解曲線就可以很快分析出來，這也是 Taqman法無法做到的。另外，由于采用 2 條模版特異的探針，雜交探針法的專一性無疑更高于其他方法，不受非特異產(chǎn)物的影響。Fret探針法由于需要合成 2條探針，探針的末端要封閉以避免反應(yīng)，所以合成的成本會比較高，也比較麻煩。但實(shí)際上， Fret 探針的設(shè)計其實(shí)比Taqman探針容易，因?yàn)門aqman探針要求一定的長度以保證探針的特異

13、性和結(jié)合模版的能力，但是長度會導(dǎo)致兩末端的熒光基團(tuán)距離遠(yuǎn)而使得熒光共振能量傳遞的效率降低，淬滅不徹底。Fret 探針就不受這個限制。不管怎么說，多數(shù)人還是習(xí)慣認(rèn)為單探針比合成2條探針要簡單。在水解和雜交探針技術(shù)之間產(chǎn)生另外一種技術(shù)：分子信標(biāo)（分子信標(biāo)產(chǎn)生時間是 1996年）分子信標(biāo)技術(shù)原理：分子信標(biāo)（ Molecular beacon ， MB ）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 1

14、5-30bp （有人認(rèn)為 18-20 個 bp 較好）長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)，莖一般 5-7bp 長（ GC 含量較高），相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。應(yīng)用：應(yīng)用于基因定量分析和突變體識別、疾病基因檢測與診斷、單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨

15、床研究中。優(yōu)點(diǎn)：本底低，特異靈敏缺點(diǎn)：雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。 探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜延伸技術(shù) ：建立在分子信標(biāo)技術(shù)基礎(chǔ)上的探針技術(shù)有 Amplifluor 、 Sunrise 、Amplisensor 、Scorpion 等，其中Sunrise技術(shù)，這一方法的特點(diǎn)是所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均能標(biāo)記上熒光分子，因此熒光信號響應(yīng)快，但無法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是其致命的不足。Amplisensor技術(shù)是一種復(fù)合探針技術(shù)，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一淬滅物。兩探針長度不同，其中淬滅物標(biāo)記探針5端多出 7個堿基（ GCGTCCC ）。 PCR 擴(kuò)增前需將熒光物標(biāo)記探針與一個半套式

16、PCR 引物連接， PCR 引物的 5 末端應(yīng)有一段與長探針互補(bǔ)的序列，以便連接酶將該引物與短探針連接。擴(kuò)增時該探針引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板，從而釋放出淬滅探針部分，破壞了FRET，而產(chǎn)生熒光。Scorpion技術(shù)（蝎形引物）則是通過在分子信標(biāo)的3 端設(shè)計連接臂連接一段引物，使 PCR 延伸反應(yīng)時不能夠延伸至分子信標(biāo)，這樣非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便無熒光信號。包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PCR 產(chǎn)物在退火時形成分子內(nèi)雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，兩個基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)出熒光。這種方法可以解決非特異的問題，同時靈敏度高，反應(yīng)快，已應(yīng)用于k-ras及 BRAC2基因的突變分析了，但這種方法不能保證雜交

17、時探針與模板完全匹配，而且合成復(fù)雜。這種技術(shù)雖然也是積累熒光（因?yàn)榻Y(jié)合上模板以后不會掉下來），但是不同于Taqman水解探針，分子信標(biāo)可以進(jìn)行溶解曲線分析，這也就是說分子信標(biāo)可以進(jìn)行包括突變檢測， SNP檢測等在內(nèi)的定量PCR延伸應(yīng)用。但是這種技術(shù)正如上面提到的探針設(shè)計復(fù)雜，穩(wěn)定性差 而這一點(diǎn)對于溶解曲線的影響頗大，因此在應(yīng)用上也需要審慎考慮。第三代：熒光引物Ampl原理：激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。ifluor目標(biāo)特異性 Amplifluor引物包含一個 5 內(nèi)部互補(bǔ)序列，標(biāo)記有熒光發(fā)技術(shù)色團(tuán)（ fluorescerin）和一個能量受體： 4- （二甲胺）氮 -

18、苯磺酸（ DABSYL ）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 3 端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的Amplifluor引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。在第一個循環(huán)中， Amplifluor引物 1 與特異 CDNA 的第一條鏈退火并被Taq酶延伸。在第二個循環(huán)中Amplifluor引物 1 延伸產(chǎn)物作為引物2 （反義鏈引物）的模板。一旦引物2 被 Taq酶延伸， Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號。隨后的擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的增強(qiáng)與擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加成比例。LUX原理：LUM(light upon extention)引物技術(shù)是 Invitrogen公司的一技術(shù)項(xiàng)專利，是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。使用類似分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計引物，使引物同時起到熒光探針的作用。引物對中的一個引物 3 端用熒光報告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號。使用LUX 引物，不需要專門設(shè)計探針，即省了成本又給實(shí)驗(yàn)設(shè)計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性