熒光定量PCR法道理匯總

1、我們前面比較詳細(xì)地介紹了熒光染料法做定量PCR的有關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品，顯然，作為定量 PCR的初期階段的熒光染料法還是有局限性的，比如，由于染料不能區(qū)分特異性 PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測(cè)的特異性始終不如后來(lái)出現(xiàn)的探針?lè)?；需要在PCR后進(jìn)行熔鏈曲線分析；也不能做多重PCR檢測(cè)（ Multiplex）。上個(gè)世紀(jì) 90年代原美國(guó) Perkin Elmer( PE) 公司開(kāi)發(fā)出了 Taqman熒光探針定量技術(shù)，將定量 PCR帶入了更廣闊的應(yīng)用空間。 Taqman探針?lè)ǖ某霈F(xiàn)是定量PCR技術(shù)的重要里程碑，之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了雜交探針?lè)?，以及熒光引物法，是?duì)探針?lè)ǖ牟粩喔?/p>

2、進(jìn)和簡(jiǎn)化。如果希望全面掌握定量PCR技術(shù)的研究人員就不能錯(cuò)過(guò)這些定量檢測(cè)技術(shù)。要提到熒光探針或者熒光引物，有一個(gè)基礎(chǔ)概念需要首先明確，那就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一對(duì)合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體(donor)和能量受體 (acceptor)對(duì),其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當(dāng)它們?cè)诳臻g上相互接近到一定距離 (1 10 nm) 時(shí)，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供

3、體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的距離等有關(guān)。定量 PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測(cè)都這個(gè) FRET原理相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光 PCR中另一個(gè)很重要的概念，即 Ct 值.C 代表循環(huán) (Cycle) ， T 代表閾值 (Threshold).Ct 值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) . 。一般取 PCR反應(yīng)的前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍。研究表明，每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

4、因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。一：水解探針?lè)═aqMan技術(shù)原理：除了一對(duì)特異性引物，TaqMan探針?lè)ㄔ黾右粭l和模版互補(bǔ)的基因特異性探針（通常 20 30bp ），探針上 5' 端和 3' 端分別標(biāo)記了一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)（供體）和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)（受體） ，在反應(yīng)初始（探針完整）時(shí)系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號(hào)被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時(shí)檢測(cè)不到供體熒光信號(hào)；而當(dāng) PCR 過(guò)程中 Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模版的位點(diǎn)時(shí)，其 5'-3' 核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針 5' 端的報(bào)告基

5、團(tuán) 游離的報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)就可以被熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。這樣每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就對(duì)應(yīng)有一個(gè)游離的熒光分子（報(bào)告基團(tuán)）形成，保證了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，因此對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)就可以實(shí)時(shí)監(jiān)控 PCR 的過(guò)程，準(zhǔn)確定量 PCR 的起始拷貝數(shù)。但是實(shí)際上探針較長(zhǎng)使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會(huì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光，都會(huì)使得本底偏高 .MGB 原理：針對(duì) Taqman探針熒光淬滅不徹底的問(wèn)題，2000 年美國(guó)技術(shù)司推出了一種新 TaqMan探針 MGB 探針（ minorgrooveABI 公binder

6、oligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3' 端采用了非熒光性的淬滅基因 淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。此外，MGB 探針的 3' 端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉 - 三肽 ( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交 ,升高探針 Tm值,使較短的探針同樣能達(dá)到較高的 Tm 值 而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近 , 淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高：一個(gè) 15bp 的 MGB 探針的信噪比大于 6, 優(yōu)于理想狀態(tài)下的

7、25bp 的普通 Taqman 探針（信噪比約為1.5 ）。允許采用更短的探針也簡(jiǎn)化了探針的設(shè)計(jì)和成本。有實(shí)驗(yàn)證明MGB 探針對(duì)于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測(cè)單堿基突變( 因?yàn)閴A基錯(cuò)配對(duì)較短探針的雜交穩(wěn)定性影響更大)水解探針之所以稱之為水解，主要是因?yàn)樗玫氖荰aq 酶的水解作用，使得探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)光信號(hào)，游離的報(bào)告基團(tuán)數(shù)目對(duì)應(yīng)PCR新擴(kuò)增產(chǎn)物，此方法檢測(cè)的是積累熒光。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，特異性高：具有模版序列特異的 Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高的定量 PCR的專一性；每擴(kuò)增一個(gè)特異產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒光染料，儀器檢測(cè)的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對(duì)檢

8、測(cè)信號(hào)沒(méi)有影響，有效提高檢測(cè)的專一性。有多種不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，使得 Taqman探針?lè)梢詫?shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測(cè)多重 PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性避免了熒光染料對(duì)PCR反應(yīng)的影響缺點(diǎn)：探針設(shè)計(jì)有一定難度，需要驗(yàn)證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高此外，也有人認(rèn)為， Taqman法利用了 Taq 酶的外切活性，而由于各家公司出產(chǎn)的 Taq 酶對(duì)于其外切酶活性并沒(méi)有做出嚴(yán)格的活性標(biāo)定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來(lái)了不確定性。至少， 生物通定量 PCR技術(shù)系列前面介紹的 Stratagene 2100 萬(wàn)美元專利之爭(zhēng)的 Fullvelocity DN

9、A 聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于 Taqman探針?lè)耍?yīng)用：Taqman技術(shù)廣泛應(yīng)用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動(dòng)物疾病病原體基因的檢測(cè)、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測(cè)定上等方面都有成功的許多例子。注意：1)探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp （最佳 20-30bp) 左右，以保證結(jié)合的特異性。2)GC堿基含量在40%-60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3) 避免與引物發(fā)生雜交或重疊。4) 探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度, 因此探針的 Tm值要比引物的 Tm 值至少高出5。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影

10、響。另外，在儀器的選擇上也要注意，盡量選擇具有4色或以上的熒光檢測(cè)通道的儀器，已保證你的機(jī)器的適用性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術(shù)是在快速發(fā)展的。二：雜交探針?lè)‵RE 原理：羅氏專利的 FRET 探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。FRET 技術(shù)探針由兩條和模版互補(bǔ)、且相鄰的特異探針組成（距離1 5bp ），上游探針的 3 端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，相鄰下游探針的5 端標(biāo)記 Red640 受體熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，兩探針同時(shí)結(jié)合在模板上，供體基團(tuán)和 Red640 受體基團(tuán)緊密相鄰（距離 1 5bp ），激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被 Red640 基團(tuán)吸收，使得檢測(cè)探頭可以檢測(cè)到 Red640

11、 發(fā)出波長(zhǎng)為 640 的熒光。當(dāng)變性時(shí)，兩探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測(cè)到 640 波長(zhǎng)的熒光。 FRET 探針檢測(cè)的信號(hào)是退火時(shí)的實(shí)時(shí)信號(hào)，每次檢測(cè)信號(hào)始終嚴(yán)格對(duì)應(yīng)模版的數(shù)量，非累積信號(hào)，可以用于做 Tm 曲線和 SNP 檢測(cè)。常用的受體熒光基團(tuán)除了 LC-Red640 還有 LC-Red705 。 兩個(gè)單標(biāo)記探針的長(zhǎng)短不影響信號(hào)的傳遞，而探針間的距離通常為 1-5bp （雖然越短越好，還是要留點(diǎn)空間避免相互之間的反應(yīng)） 。我們前面提到， Taqman水解探針?lè)ㄖ?，一但?bào)告基團(tuán)水解離開(kāi)淬滅基團(tuán)，就一直游離于反應(yīng)體系中可被檢測(cè)，所以檢測(cè)的是累積熒光，是不可逆的。雜交探針不同，是復(fù)性時(shí)兩條特異

12、探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，到升溫變性探針遠(yuǎn)離模版就沒(méi)有信號(hào)，所以檢測(cè)的是實(shí)時(shí)信號(hào)，是可逆的，所以可以進(jìn)行熔解曲線的分析，還可以用于進(jìn)行突變分析， SNP 基因分型以及產(chǎn)物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點(diǎn)突變，通過(guò)熔解曲線就可以很快分析出來(lái)，這也是 Taqman法無(wú)法做到的。另外，由于采用 2 條模版特異的探針，雜交探針?lè)ǖ膶Ｒ恍詿o(wú)疑更高于其他方法，不受非特異產(chǎn)物的影響。Fret探針?lè)ㄓ捎谛枰铣?2條探針，探針的末端要封閉以避免反應(yīng)，所以合成的成本會(huì)比較高，也比較麻煩。但實(shí)際上， Fret 探針的設(shè)計(jì)其實(shí)比Taqman探針容易，因?yàn)門aqman探針要求一定的長(zhǎng)度以保證探針的特異

13、性和結(jié)合模版的能力，但是長(zhǎng)度會(huì)導(dǎo)致兩末端的熒光基團(tuán)距離遠(yuǎn)而使得熒光共振能量傳遞的效率降低，淬滅不徹底。Fret 探針就不受這個(gè)限制。不管怎么說(shuō)，多數(shù)人還是習(xí)慣認(rèn)為單探針比合成2條探針要簡(jiǎn)單。在水解和雜交探針技術(shù)之間產(chǎn)生另外一種技術(shù)：分子信標(biāo)（分子信標(biāo)產(chǎn)生時(shí)間是 1996年）分子信標(biāo)技術(shù)原理：分子信標(biāo)（ Molecular beacon ， MB ）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見(jiàn)光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 1

14、5-30bp （有人認(rèn)為 18-20 個(gè) bp 較好）長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)，莖一般 5-7bp 長(zhǎng)（ GC 含量較高），相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開(kāi)，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。應(yīng)用：應(yīng)用于基因定量分析和突變體識(shí)別、疾病基因檢測(cè)與診斷、單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨

15、床研究中。優(yōu)點(diǎn)：本底低，特異靈敏缺點(diǎn)：雜交時(shí)探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。 探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜延伸技術(shù) ：建立在分子信標(biāo)技術(shù)基礎(chǔ)上的探針技術(shù)有 Amplifluor 、 Sunrise 、Amplisensor 、Scorpion 等，其中Sunrise技術(shù)，這一方法的特點(diǎn)是所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均能標(biāo)記上熒光分子，因此熒光信號(hào)響應(yīng)快，但無(wú)法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是其致命的不足。Amplisensor技術(shù)是一種復(fù)合探針技術(shù)，一個(gè)探針上連接一種熒光物，另一探針連接一淬滅物。兩探針長(zhǎng)度不同，其中淬滅物標(biāo)記探針5端多出 7個(gè)堿基（ GCGTCCC ）。 PCR 擴(kuò)增前需將熒光物標(biāo)記探針與一個(gè)半套式

16、PCR 引物連接， PCR 引物的 5 末端應(yīng)有一段與長(zhǎng)探針互補(bǔ)的序列，以便連接酶將該引物與短探針連接。擴(kuò)增時(shí)該探針引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板，從而釋放出淬滅探針部分，破壞了FRET，而產(chǎn)生熒光。Scorpion技術(shù)（蝎形引物）則是通過(guò)在分子信標(biāo)的3 端設(shè)計(jì)連接臂連接一段引物，使 PCR 延伸反應(yīng)時(shí)不能夠延伸至分子信標(biāo)，這樣非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便無(wú)熒光信號(hào)。包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PCR 產(chǎn)物在退火時(shí)形成分子內(nèi)雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，兩個(gè)基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)出熒光。這種方法可以解決非特異的問(wèn)題，同時(shí)靈敏度高，反應(yīng)快，已應(yīng)用于k-ras及 BRAC2基因的突變分析了，但這種方法不能保證雜交

17、時(shí)探針與模板完全匹配，而且合成復(fù)雜。這種技術(shù)雖然也是積累熒光（因?yàn)榻Y(jié)合上模板以后不會(huì)掉下來(lái)），但是不同于Taqman水解探針，分子信標(biāo)可以進(jìn)行溶解曲線分析，這也就是說(shuō)分子信標(biāo)可以進(jìn)行包括突變檢測(cè)， SNP檢測(cè)等在內(nèi)的定量PCR延伸應(yīng)用。但是這種技術(shù)正如上面提到的探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，穩(wěn)定性差 而這一點(diǎn)對(duì)于溶解曲線的影響頗大，因此在應(yīng)用上也需要審慎考慮。第三代：熒光引物Ampl原理：激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。ifluor目標(biāo)特異性 Amplifluor引物包含一個(gè) 5 內(nèi)部互補(bǔ)序列，標(biāo)記有熒光發(fā)技術(shù)色團(tuán)（ fluorescerin）和一個(gè)能量受體： 4- （二甲胺）氮 -

18、苯磺酸（ DABSYL ）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 3 端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的Amplifluor引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號(hào)。在第一個(gè)循環(huán)中， Amplifluor引物 1 與特異 CDNA 的第一條鏈退火并被Taq酶延伸。在第二個(gè)循環(huán)中Amplifluor引物 1 延伸產(chǎn)物作為引物2 （反義鏈引物）的模板。一旦引物2 被 Taq酶延伸， Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨后的擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)的增強(qiáng)與擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加成比例。LUX原理：LUM(light upon extention)引物技術(shù)是 Invitrogen公司的一技術(shù)項(xiàng)專利，是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。使用類似分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，使引物同時(shí)起到熒光探針的作用。引物對(duì)中的一個(gè)引物 3 端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒(méi)有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。使用LUX 引物，不需要專門設(shè)計(jì)探針，即省了成本又給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了寬松的條件。由于沒(méi)有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性