幾種PCR擴增的比較

1、普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的基本原理和操作步驟普通PCR1概述 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是于197

2、6年從溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相關的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關的論文

3、發(fā)表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。 2 PCR原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序

4、列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 3. PCR反應體系與反應條件3.1標準的PCR反應體系 10擴增緩沖液 10l 4種dNTP混合物 200l 引物 10100l 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5 l Mg2+ 1.5mmol/

5、L 加雙或三蒸水 100 l 3.2 PCR反應五要素參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。PCR步驟標準的PCR過程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PC

6、R因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60-65間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。 4 PCR反應特點4.1特異性強 PCR反應的特異性決定因素為： 底物與模板DNA特異正確的結合； 堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； 基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確

7、度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 4.2 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(g=10-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。4.3簡便、快速PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在24 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4.4對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及

8、培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。 5 PCR常見問題 5.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨

9、意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡

10、其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性

11、;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 5.2假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。 引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

12、：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 5.3 出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非

13、特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。 5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有

14、：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。原位PCR在科學研究中，每一項新技術的創(chuàng)立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動著各學科的發(fā)展。縱觀形態(tài)研究領域，50年代電子顯微鏡引入形態(tài)學觀察領域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用，又將觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平，使細胞內眾多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫(yī)學生物學的發(fā)展無疑產(chǎn)生了深刻的影響。70年代，分子生物學技術在形態(tài)學中的廣泛應用，隨著原位雜交技術的出現(xiàn)，使組織細胞內特定的DNA或RNA序

15、列能夠被定位，將蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現(xiàn)象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR多聚酶鏈反應技術問世了，很快地就被引入形態(tài)學觀察的領域，使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世，必將帶來更多的研究成果，使形態(tài)學的研究又向前邁出一大步。 1基本原理原位PCR技術的基本原理，就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技術是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，

16、將引物引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增，經(jīng)過擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術具有靈敏度高，特異性強的優(yōu)勢，隨著熱循環(huán)自動化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是，PCR技術是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態(tài)結構聯(lián)系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。 原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來，保持了兩項技術的優(yōu)勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經(jīng)化學固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜均

17、具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術檢查。 2基本類型根據(jù)在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉錄原位PCR技術等。 2.1直接法原位PCR技術直接法原位PCR技術是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子，即使用標記的三

18、磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時，標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現(xiàn)出來。常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。直接法原位PCR技術的優(yōu)點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現(xiàn)假陽性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。因為在制片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會導致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復，這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用標記引物的方法進

19、行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。 2.2間接法原位PCR技術 間接法原位PCR技術師現(xiàn)在細胞內進行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現(xiàn)先擴增的目的，然后用原位雜交技術去檢測細胞內已擴增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術的優(yōu)點是特異性較高，擴增效率也較

20、高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。 2.3原位反轉錄PCR技術原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PC技術應用到組織細胞標本中的一種新技術，與RT-PCR（液相）不同點在于，進行原位反轉錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。 3基本步驟原位PCR技術的基本步驟包括標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下（重點以石蠟切片為例）。

21、3.1標本的制備原位PCR技術可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標本經(jīng)制片后，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導致擴增的產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。 組織細胞的固定:一般認為組織

22、細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以44-6小時為宜。 切片的厚度:一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態(tài)學觀察的效果就差了，分辨率也將下降。 玻片的處理:為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。 蛋白酶的消化作用:在進行原位擴增之前，組織標本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允

23、許反應體系中的各成分進入細胞內，并能很好的暴露靶序列，以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進行的PCR反應體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利于后續(xù)進行的各反應成分進入細胞內或核內，但同時也使得擴增產(chǎn)物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。 原位擴增（PCR） 原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物:PCR所用的引物一般為15

24、-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp，RNA很少超過200bp，較長序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現(xiàn)。 反應體系:原位PCR的反應體系與常規(guī)的液相PCR基本相同，由于是在經(jīng)過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。 熱循環(huán):原位PCR的熱循環(huán)可在專門的熱循環(huán)儀上進行，操作簡便。也可在一般的PCR熱

25、循環(huán)儀上進行，通常在樣品臺上覆蓋一層鋁箔，制成平臺，樣品臺上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺上，即可進行熱循環(huán)的步驟。為了保證進行充分的擴增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時間可比常規(guī)PCR略長些，另外，也可采用熱啟動（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94時，再立即加入TaqDNA聚合酶。 為了保證反應體系在熱循環(huán)過程不過多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。 洗滌:原位擴增結束后，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產(chǎn)物。洗滌不充分，會導致擴增產(chǎn)物在檢測時顯現(xiàn)，造成背景過深或假陽性結果的出現(xiàn)。但是，洗滌過度，也會造成細胞內擴增的產(chǎn)物被洗脫，是陽性信

26、號減弱或丟失。有作者在擴增后用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行后固定，以使擴增的產(chǎn)物在檢測時能很好地保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。 原位檢測:原位PCR的擴增產(chǎn)物檢測方法，取決于原位PCR的設計方案，直接法則根據(jù)標記分子的性質對擴增產(chǎn)物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。 4原位PCR技術的應用 原位PCR技術的突出優(yōu)勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數(shù)較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。 4.1用于外源性基因的檢測 4.1.1病毒基因的檢測 感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術

27、應用后，使這一極為困難的問題有望解決。 對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發(fā)現(xiàn)受感染的人群。 4.1.2細菌基因的檢測 最突出的應用是在結核桿菌的檢測上，當結核病變不夠典型時，經(jīng)過特殊染色的方法很難在鏡下找到結核桿菌，而應用原位PCR技術可幫助明確診斷，當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。 4.1.3導入基因的檢測 在轉基因動物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體內，是否接受了導入的基因，均可用原位PCR技術來證實。因此，原位PCR技術成為重要的檢測手段。 4.2 用于

28、內源性基因的檢測4.2.1異常基因的檢測 機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。 4.2.2固有基因的檢測 對于機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術因基因拷貝數(shù)太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能確定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足，使得我們能夠對人類各種基因進行檢測，而完成人類基因圖的繪制。 反向PCR反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR

29、擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究. 反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DN

30、A分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。 PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。 反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3端是相互反向的。擴增前先用限制性內切

31、酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。 該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。 利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索

32、鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。 用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環(huán)化類 型決定的接點(例如，互補突頭

33、連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。 用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實驗中，為產(chǎn)生對反向 PCR大小適當?shù)腄NA片段需要兩種內切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切 酶失活。 聚合酶鏈反應條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94-30秒變性，58-30秒引物退火， Taq聚合酶70延伸3分鐘，進行30個循

34、環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測序時，與核心區(qū)末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。 描述一種大聚合酶鏈反應應用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側的未知 成幾何級數(shù)擴增用適當?shù)南拗菩詢惹辛呀夂诵膮^(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū) 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)這種反向方法可用于擴增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應用于制備未知序列 探針或測定邊側區(qū)域本身的上下游序列。逆轉錄PCR1概念RT-PCR 為

35、反轉錄RCR（reverse transcription PCR）和實時PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉錄PCR，或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。 由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。 RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，