雜種細胞的篩選和鑒定

1、雜種細胞的篩選和鑒定利用細胞融合技術(shù)可以按照人們的意愿創(chuàng)造新品種和提取 有用的細胞代謝產(chǎn)物。由于細胞間的融合率相對較低，而且 不一定能得到我們預(yù)期的融合細胞，因此在實際操作中，常 常用大量的細胞進行融合，一方面能夠產(chǎn)生大量的融合細 胞，可以從中分離由我們所需要的雜種細胞，從而提高實驗 的成功率，另一方面細胞間的融合是隨機的，融合細胞的類 型很多，雜種細胞的篩選和鑒定是操作流程中十分重要的環(huán) 節(jié)。2003年上海高考生物卷第 36題，以雜交瘤細胞的篩 選和雜種細胞染色體缺失為情境，考查學生對融合細胞的類型、雜種細胞篩選的原理、基因與酶的關(guān)系等方面的理解和 應(yīng)用?，F(xiàn)行多個版本的現(xiàn)代生物科技專題教科書

2、中，對 雜種細胞的篩選和鑒定這一環(huán)節(jié)都作了隱性化處理，如何處理教材的隱性化與考試的顯性化這一矛盾，是目前許多教師思考的問題。本文通過雜種細胞的篩選和鑒定方法的介紹， 提由相關(guān)的教學建議。1 雜種細胞的篩選方法兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細 胞，如沒有發(fā)生融合的親本細胞、同核體（同源原生質(zhì)體的融合體）、異核體（非同源的原生質(zhì)體的融合體）、多核體（含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體）等。1.1 利用物理特性篩選法根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異等特性 來篩選雜種細胞。如親本1用異硫匐酸熒光素（綠色）標記， 親本2用堿性蕊香紅熒光素（紅色）標記，在熒光

3、顯微鏡下， 就可以找到雜種細胞。 這種方法的缺點物理特性常常難以滿 足、分離工作量大、挑選由來極少數(shù)細胞不容易增殖等。1.2 營養(yǎng)缺陷互補篩選法親本雙方都有營養(yǎng)缺陷的情況下，只有雜種細胞能在特定的條件下生存，如親本 1是葉 綠體缺陷型，親本 2是光致死型，親本1的細胞和同核體在 培養(yǎng)時呈白色，親本 2的細胞和其同核體在光照死亡，只有 雜種細胞能培養(yǎng)成綠色植株。1.3 選擇培養(yǎng)基篩選法利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞， 如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原 生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其雜種細胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加入植物激素，因此使用無植物激素 的培養(yǎng)基，可以達到篩選目

4、的。動物細胞工程中，雜交瘤細胞的篩選普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液，在普通的動物細胞培養(yǎng)液中加入次黃喋吟、氨基喋吟和胸腺喀廢核昔酸。其依據(jù)的原理是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（D途徑），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核昔酸，為DN6子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這 一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基喋吟是一種葉酸的拮抗物，可 以阻斷DN*成的D途徑。另一條途徑是應(yīng)急途徑或補救途 徑（S途徑），它是利用次黃喋吟一鳥喋吟磷酸核昔轉(zhuǎn)移酶 和胸腺喀陡核昔激酶催化次黃喋吟和胸腺喀陡核昔生成相 應(yīng)的核昔酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細

5、胞和兩個效應(yīng) B細胞融合的D途徑被氨基喋 吟阻斷，雖S途徑正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能 力，一般10d左右死亡。對骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而 言，通常采用的骨髓瘤細胞是次黃喋吟一鳥喋吟磷酸核昔轉(zhuǎn) 移酶缺陷型細胞，因此自身沒有 S途徑，且D途徑又被氨基 喋吟阻斷，所以在 HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。惟 有雜交瘤細胞，既具有效應(yīng) B細胞的S途徑，又具有骨髓瘤 細胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此通過HAT培養(yǎng)液可篩選由雜交瘤細胞。2 雜種細胞的鑒定方法雜種細胞的篩選過程中，必需保證雜種細胞的生理 活性不受損傷，才能進行細胞培養(yǎng)獲得新品種或細胞代謝產(chǎn)物。有時無法直接篩選由預(yù)期的雜

6、種細胞，可以對融合細胞 進行培養(yǎng)甚至形成植株，再進行形態(tài)學、細胞學或分子生物 學上的鑒定；有時能夠篩選由雜種細胞，需要對細胞代謝產(chǎn) 物進行鑒定。2.1 形態(tài)學鑒定根據(jù)雙親的形態(tài)學特征進行鑒定，如葉片大小與形狀，花的形狀與顏色、葉脈、葉柄、花梗及表皮 毛等，觀察并比較組織培養(yǎng)產(chǎn)生的新植株與雙親在表現(xiàn)型上 的差異。2.2 細胞學鑒定利用顯微鏡進行細胞器分析、染色體組型分析、基因組原位雜交等鑒定雜種細胞。理論上講如果染 色體不丟失，雜種細胞中染色體數(shù)目應(yīng)為雙親染色體數(shù)目之 和。2.3 同功酶鑒定同功酶是催化同一化學反應(yīng)而化學組成不同的一組酶，它們彼此在氨基酸序列、底物的親和性等方 面都存在著差異。同

7、功酶的多重分子形態(tài)是特定基因的產(chǎn) 物。雜種細胞中的同功酶譜一般是雙親酶譜之和。2.4 分子生物學鑒定隨著分子生物學的發(fā)展，人們已經(jīng)找到了對雜種細胞進行鑒定、分析的更為有效的方法，如 限制性片段長度多態(tài)性（RFLB、隨機擴增多態(tài)性（RAPD 和擴增片段長度多態(tài)性（AFL?等。3 相關(guān)內(nèi)容的教學建議3.1 比較雜種細胞篩選和鑒定的差異雜種細胞的篩選和鑒定是兩個不同的過程，在教學過程中需要加以辨析。從時 間上，雜種細胞的篩選先于雜種細胞的鑒定；從功能上，雜 種細胞的篩選可以避免細胞培養(yǎng)的盲目性，雜種細胞的鑒定可以確認實驗的成功與否；從細胞生理狀態(tài)上，雜種細胞的 篩選時雜種細胞生理活性不能到受損傷，而

8、雜種細胞的鑒定可以在細胞死亡后進行。3.2 理解雜交瘤細胞的兩次篩選在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中，由于效應(yīng)B淋巴細胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選生的雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體存在差異，必須對雜交瘤細胞群中進行第二次篩選，選由能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。二次篩選通常采用有限稀釋克隆細胞的方法，將 雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養(yǎng)板上，使每孔 細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖，然后檢測各孔上清液 中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），上清液可 與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔，陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，繼續(xù)進行有限稀釋，一般重復(fù)34次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克

9、隆細胞。第二次篩 選也是鑒定的過程。3.3把握新授課與復(fù)習課的特點雜種細胞的篩選和鑒定在現(xiàn)代生物科技專題中是隱性的，而雜種細胞的篩 選和鑒定需要應(yīng)用的生物學知識較復(fù)雜，雖然部分方法在必修模塊的學習過程中已經(jīng)涉及，但是對學生的知識的遷移能力和創(chuàng)新能力要求較高，超由他們現(xiàn)有的認知水平。普通高中生物課程標準具體的內(nèi)容標準是“舉 例說由細胞融合與單克隆抗體”，屬于了解水平的要求。因 此，新授課的課堂教學的重點是植物體細胞雜交、動物細胞 融合和單克隆抗體生產(chǎn)的過程，對雜種細胞的篩選和鑒定的意義作詳細說明，而具體的方法不進行拓展，或者課堂上只 進行簡短的討論，激發(fā)學生課后繼續(xù)探究的熱情，切不可將 2003年上海生物高考第 36題在新授課呈現(xiàn)由來，或者作為 家庭作