崔志鋼的論文

1、基因槍介導(dǎo)GmDREB3基因轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織的研究崔志鋼1,陳耀鋒1,周文麗1,楊梅1,徐東北1（1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）摘要 為了提高小麥的抗逆性，本實(shí)驗(yàn)通過基因槍共轉(zhuǎn)化途徑，將GmDREB3基因和抗除草劑bar基因通過共轉(zhuǎn)化途徑同時(shí)導(dǎo)入小麥品種小偃22。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小麥幼胚通過9天的愈傷組織誘導(dǎo)，基因槍轟擊金粉用量為60g/槍，分別添加NAA和KT 1mg/L的MS培養(yǎng)基，這一組合獲得抗性再生植株頻率最高。并對再生植株進(jìn)行PCR檢測表明，目的基因已整合到小麥染色體組。關(guān)鍵詞 基因槍;愈傷組織;恢復(fù)培養(yǎng);篩選分化;再生植株中圖分類號 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編

2、號 Studies of transformation of the GmDREB3 gene into Immature Embryos of Wheat by Particle BombardmentCUI Zhigang ,CHEN YaoFeng,ZHOU WenLi,YANG Mei,XU DongBei( 1 College of Agronomy , Northwest A&F University , Yangl ing , Shaanxi 712100, China)Abstract: Key words: gene gun；callus；recovery cultu

3、re；screening and differentiation；regeneration plant小麥轉(zhuǎn)基因研究始于20世紀(jì)90年代初期，近些年來，大量有關(guān)轉(zhuǎn)基因科研工作的開展，使小麥轉(zhuǎn)基因有了迅速的發(fā)展。但由于小麥轉(zhuǎn)化研究起步較晚，普遍存在轉(zhuǎn)化頻率低的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還有待進(jìn)一步完善，因此有必要對轉(zhuǎn)化過程中的諸多影響因素進(jìn)行研究。從而提高小麥轉(zhuǎn)化頻率，加快轉(zhuǎn)基因小麥的應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。本研究對基因槍法轉(zhuǎn)化小麥中的愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間，金粉用量，篩選分化培養(yǎng)基等影響因素進(jìn)行了研究，為完善小麥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供一定的依據(jù)。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基1.1.1 受體材料以小麥幼胚愈傷組織為基因

4、槍轟擊的受體材料。小麥材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田種植的黃淮麥區(qū)優(yōu)良小麥品種(系) 小偃22。1.1.2 載體和引物攜帶GmDREB3基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒為pKS,攜帶篩選標(biāo)記抗除草劑（bar）基因的質(zhì)粒載體為PAHC20,由北京農(nóng)科院馬有志老師提供。設(shè)計(jì)的特異引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,序列如下:5引物CAGAGGAGCATAGCGATTCCAAGTA3引物TCCCGTAATCGGATGCGTAACCACT1.1.3培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基: MS + 2 , 4-D 2. 0mg/ L + 蔗糖30 g/ L + Ag5. 0 g/ L(p H5. 8) ;高滲培養(yǎng)

5、基:MS + 山梨醇0.2mol/L+ 甘露醇0.2mol/L + Ag 6. 0 g/ L (p H 5. 8) ;恢復(fù)培養(yǎng)基: SD2 + 2 , 42D 2. 0 mg/ L + 蔗糖30 g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8) ;篩選分化培養(yǎng)基: MS+NAA0.1mg/L+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；1/2MS+NAA0.5mg/L+KT1.0mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；MS+NAA0.1mg/L

6、+KT3mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；1/2MS+KT1.0 mg/L +NAA1.0mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L+ Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；MS+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)。生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA0.5mg/L+Bialaphos2mg/L+多效唑4mg/L+蔗糖30g/L+Ag 6. 0g/ L (p H5.8)；壯苗培養(yǎng)基：1/2MS+Bialaphos 2mg/

7、L+多效唑4 mg/L +蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/所有培養(yǎng)基均采用高溫高壓滅菌,篩選劑采用過濾滅菌,培養(yǎng)基冷卻至50-60 左右時(shí)加入。1. 2 方法1. 2. 1 幼胚愈傷組織誘導(dǎo)于田間剪取授粉14左右的麥穗，剝?nèi)∮啄鄯N子，于超凈工作臺內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75 %的酒精表面消毒30 s ,再用1 g/ L的升汞滅菌810 min ,滅菌過程中不停的搖動麥粒，無菌水沖洗5次,剝?nèi)∮着?平面向上接種到幼胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,26下黑暗培養(yǎng),誘導(dǎo)時(shí)間分別為：3d，6d，9d，12d。1. 2. 2 高滲處理小麥愈傷組織在直徑9 cm 的培養(yǎng)皿上鋪一薄層高滲培養(yǎng)基,將幼胚愈傷組織按原生長

8、方向緊密擺放于培養(yǎng)皿中央直徑3 cm 范圍之內(nèi)，在轟擊前6 h對幼胚愈傷組織進(jìn)行高滲處理。 1. 2. 3基因槍轉(zhuǎn)化采用PDS-1000/He基因槍（bia-rod公司生產(chǎn)）轟擊小麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織。基因槍轟擊壓力為1100 p si ,真空度為3 733 Pa ,金粉直徑為1. 0 m ,轟擊距離為9 cm ,每槍金粉用量分別為30g、60g、120g ，質(zhì)粒DNA用量為1.0g 。轟擊后轟擊后16-18 h在原高滲培養(yǎng)基上對幼胚愈傷組織進(jìn)行高滲處理。高滲處理后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行14 d 的暗恢復(fù)培養(yǎng)。1. 2. 4篩選分化對恢復(fù)14d 后的愈傷組織用5種不同篩選分化培養(yǎng)基附

9、加2mg/LBialaphos進(jìn)行再生篩選，在24光照10h條件下篩選分化培養(yǎng)6-7周。1. 2. 5 生根壯苗待到愈傷組織分化出綠芽以后，將分化的綠芽轉(zhuǎn)入附加4mg/L多效唑的生根培養(yǎng)基上直到小苗伸長（光照與溫度同前），待到小苗伸長到4-5cm時(shí)，移入壯苗培養(yǎng)基上壯苗，再生植株生長到適宜大?。绺?-8cm，根系較好）時(shí)移入培養(yǎng)缽中，在15左右光照培養(yǎng)，待苗壯后置于溫室。 1. 2. 6轉(zhuǎn)化植株的PCR 檢測對篩選得到的抗性再生植株,用CTAB 法提取葉片基因組DNA 進(jìn)行PCR 檢測,以攜帶目的基因的質(zhì)粒為陽性對照,以未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植株DNA為陰性對照,擴(kuò)增條件為:94 5 min ;94

10、45 s ,58 45 s , 72 90 s ,35 個(gè)循環(huán);72 延伸10 min。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,將擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/ L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測并照相。2結(jié)果與分析2.1小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間對基因槍轟擊后植株再生率有顯著影響在其他條件相同的情況下，隨著愈傷組織誘導(dǎo)天數(shù)的增加，再生植株率明顯升高，但誘導(dǎo)時(shí)間增加到12天，再生植株率略有下降。在高滲透處理前,小麥幼胚愈傷組織的生長狀態(tài)和生理狀態(tài)直接影響著基因槍轉(zhuǎn)化效率的高低,不能或者難以啟動再分化的愈傷組織不宜作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體。本研究表明（表1）,經(jīng)過9天的誘導(dǎo)的小麥幼胚愈傷組織最佳狀態(tài)，其狀態(tài)為黃豆大小、略呈淡黃色、結(jié)構(gòu)致密（

11、圖1）。此時(shí)的愈傷組織生理活性高,再生能力強(qiáng),較為容易接受和整合外源基因 。同時(shí),這類愈傷組織受轟擊后恢復(fù)能力較強(qiáng),再生并分化成完整植株的幾率高。而呈白色或青白色、透明水浸狀且質(zhì)地松軟的愈傷組織（圖2）,由于其本身生理活性較低,在接受基因槍轟擊后,細(xì)胞受損更加嚴(yán)重,難以恢復(fù),生長增殖也受到抑制,目的基因幾乎不能整合并通過植株再生得以表達(dá)。2.2不同金粉用量對基因槍轟擊后植株再生頻率的影響表2表明，在其他條件相同的情況下，基因槍轟擊時(shí)金粉用量為60g/槍，再生植株率較高?；驑屴Z擊幼胚愈傷組織金粉用量過大將會給愈傷組織帶來不可逆轉(zhuǎn)的損傷，使愈傷組織很難或者失去分化為再生植株的能力。而過低的金粉用

12、量會間接的降低外源DNA的用量，從而降低基因槍轉(zhuǎn)化效率。2.3 篩選分化培養(yǎng)基類型以及添加激素的量對基因槍轟擊后植株再生頻率的影響表3在基因槍轟擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,從經(jīng)滲透處理和恢復(fù)培養(yǎng)后得到的植株的再生頻率還可以看出（表3）,在同一誘導(dǎo)時(shí)間, 同一金粉用量，使用篩選分化培養(yǎng)基MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L的分化頻率高于其它四個(gè)培養(yǎng)基。 圖1 圖2 Fig.1 Fig.2 表1 幼胚愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間對再生植株率的影響Table 1 Young embryo callus induction time of regenerative plants rate in

13、fluence誘導(dǎo)時(shí)間（天）愈傷組織塊數(shù)（塊）再生植株（株）植株再生率（%）330200630531.09306134.241230182.66表2金粉用量對基因槍轟擊后植株再生頻率的影響Table 2 Gold content on the gene gun bombardment after plantlet regeneration frequency influence金粉用量（g）愈傷組織塊數(shù)（塊）再生植株（株）植株再生率（%）3036261.6660385153.9012035141.14表3篩選分化培養(yǎng)基及添加激素的量對植株再生頻率的影響Table 3 Screening dif

14、ferentiation media and the adding hormone amount of plantlet regeneration frequency influence篩選分化培養(yǎng)基愈傷組織塊數(shù)（塊）再生植株（株）植株再生率（%）191380.99287691.033896121.34 4888333.72 5896202.232. 4 轉(zhuǎn)化植株的PCR 檢測對*株經(jīng)移栽成活且長勢良好的再生苗的PCR 檢測結(jié)果表明, *株苗均在450 bp 處有1 條與質(zhì)粒DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物一致的特異帶,而對照植株未能擴(kuò)增出基因片段。初步表明目的基因已經(jīng)整合到小麥基因組中。轉(zhuǎn)化植株的PCR 檢

15、測結(jié)果（圖3）3 討論基因槍法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，在禾谷類作物上應(yīng)用比較廣泛。遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵包括建立具有高頻再生能力的受體系統(tǒng)和優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件。影響基因槍法轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織的影響因素有多種。在影響基因槍轉(zhuǎn)化的因素中，愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間、金粉用量以及篩選分化培養(yǎng)基成分是影響轉(zhuǎn)化頻率的關(guān)鍵因素。隨著愈傷組織誘導(dǎo)天數(shù)的增加，再生植株率明顯升高，但誘導(dǎo)時(shí)間增加到12天，再生植株率有所下降。在高滲透處理前,小麥幼胚愈傷組織的生長狀態(tài)和生理狀態(tài)直接影響著基因槍轉(zhuǎn)化效率的高低,不能或者難以啟動再分化的愈傷組織不宜作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體。經(jīng)過9天的誘導(dǎo)的小麥幼胚愈傷組織最佳狀態(tài)，其狀態(tài)為黃豆大小、略呈淡黃色、結(jié)

16、構(gòu)致密。此時(shí)的愈傷組織生理活性高,再生能力強(qiáng),較為容易接受和整合外源基因 。同時(shí),這類愈傷組織受轟擊后恢復(fù)能力較強(qiáng),再生并分化成完整植株的幾率高。金粉顆粒越多，轟擊對細(xì)胞造成的損傷程度越大，使受損的細(xì)胞不能恢復(fù)或恢復(fù)速度很慢，從而降低轉(zhuǎn)化率。然而過低的金粉用量，又會使外源DNA的量降低，從而降低外源基因整合頻率。在基因槍轟擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,從經(jīng)滲透處理和恢復(fù)培養(yǎng)后得到的植株的再生頻率還可以看出,同一誘導(dǎo)時(shí)間,分別添加NAA1毫克和KT 1毫克的MS培養(yǎng)基分化頻率最高。因此，本研究通過大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：小麥幼胚通過9天的愈傷組織誘導(dǎo)，基因槍轟擊金粉用量為60g/槍，分別添加NAA和KT 1mg的MS培養(yǎng)基，這一組合獲得抗性再生植株頻率最高?；驑屴D(zhuǎn)化的當(dāng)代植株多為嵌合體，這在許多植物上均有表現(xiàn)，是一個(gè)普