實驗五、無菌操作及接種技術(shù)

1、精選課件1實驗實驗七七無菌操作及接種技術(shù)無菌操作及接種技術(shù) 一、微生物接種技術(shù)一、微生物接種技術(shù)一）、實驗?zāi)康囊唬?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)微生物接種工具的使用，掌握無菌操作方法，建立學(xué)習(xí)微生物接種工具的使用，掌握無菌操作方法，建立有菌概念。有菌概念。二）、實驗原理二）、實驗原理無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。接種：接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程。的生物體內(nèi)的過程。三）實

2、驗用品三）實驗用品 四）實驗步驟：四）實驗步驟：1、接種工具的介紹、接種工具的介紹 接種環(huán)、接種鉤、接種針、接種圈、接種鋤、玻璃涂棒、其接種環(huán)、接種鉤、接種針、接種圈、接種鋤、玻璃涂棒、其他接種工具他接種工具2 2、超凈工作臺、超凈工作臺 超凈工作臺是為實驗室工作提供無菌操作環(huán)境的設(shè)施，超凈工作臺是為實驗室工作提供無菌操作環(huán)境的設(shè)施，以保護實驗免受外部環(huán)境的影響，同時為外部環(huán)境提供以保護實驗免受外部環(huán)境的影響，同時為外部環(huán)境提供某些程度的保護以防污染并保護操作者。某些程度的保護以防污染并保護操作者。 原理：超凈工作臺的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔原理：超凈工作臺的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈

3、空氣凈空氣( (進濾空氣進濾空氣) )按設(shè)定的方向流動而形成的。以氣流按設(shè)定的方向流動而形成的。以氣流方向來分，現(xiàn)有的超凈工作臺可分為垂直式，由內(nèi)向外方向來分，現(xiàn)有的超凈工作臺可分為垂直式，由內(nèi)向外式以及側(cè)向式。式以及側(cè)向式。 垂直流超凈工作臺 水平流超凈工作臺水平流超凈工作臺 垂直流超凈工作臺垂直流超凈工作臺 超凈臺的使用與維護超凈臺的使用與維護o風(fēng)速保持在風(fēng)速保持在0.32-0.480.32-0.48米米/ /秒秒o使用前打開紫外燈照射使用前打開紫外燈照射4060mino開啟超凈工作臺工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用開啟超凈工作臺工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或的酒精或0.5%過過氧乙酸

4、噴灑擦拭消毒工作臺面。氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺面。o使用中，有機玻璃罩受到污染，嚴禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布使用中，有機玻璃罩受到污染，嚴禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭；檫拭；o請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物；請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物；o使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；o使用完畢后，使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫用消毒液擦拭工作臺面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射外燈照射15min. .o定期做無菌試驗，以測定凈化臺是否符合無菌要求。定期做無菌試驗，以測定凈化臺是否符合無菌要求。2、無菌操作要點、無菌操作要

5、點1 1）、要求建立）、要求建立“有菌概念有菌概念”。2 2）、接種時要有一個潔凈的環(huán)境，整個操作過）、接種時要有一個潔凈的環(huán)境，整個操作過程必須在火焰旁進行。程必須在火焰旁進行。3 3）接種環(huán)，棉塞一定要拿在手上，不能隨便亂）接種環(huán)，棉塞一定要拿在手上，不能隨便亂丟。丟。3、微生物接種技術(shù)、微生物接種技術(shù)1 1）、斜面接種技術(shù)）、斜面接種技術(shù) 從斜面菌種將菌移接至另一斜面培養(yǎng)基的從斜面菌種將菌移接至另一斜面培養(yǎng)基的方法，叫做斜面接種方法，叫做斜面接種。接種方法：接種方法：A A、接種前用酒精棉球擦凈桌面；、接種前用酒精棉球擦凈桌面；B B、將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種、將試管貼上

6、標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；C C、點燃酒精燈以后，在火焰旁將每一支試管內(nèi)的、點燃酒精燈以后，在火焰旁將每一支試管內(nèi)的棉塞稍微轉(zhuǎn)一下，使其松動，以便在接種時易拔出，棉塞稍微轉(zhuǎn)一下，使其松動，以便在接種時易拔出，并將試管放在試管架上，放在接種臺的右前方；并將試管放在試管架上，放在接種臺的右前方；D D、將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管，用大拇指和、將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分，斜向上，并使他們呈水平位置，也可將試管橫分，斜向上，并

7、使他們呈水平位置，也可將試管橫放在左手掌中央，用四個手指托住試管，大拇指壓放在左手掌中央，用四個手指托住試管，大拇指壓在試管上，斜面向上；在試管上，斜面向上；E E、右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)的部分燒紅滅菌，、右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)的部分燒紅滅菌，環(huán)以上凡在接種可能進入試管內(nèi)的部分，均應(yīng)通過環(huán)以上凡在接種可能進入試管內(nèi)的部分，均應(yīng)通過火焰灼燒。（見圖火焰灼燒。（見圖4 4）圖4 接種環(huán)滅菌以下操作，需要使管口靠近火旁以下操作，需要使管口靠近火旁F F、用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；、用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；G G、以火焰灼燒管口，灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口，、以火焰灼燒管口，灼燒

8、時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口，使試管口沾染的少量菌得以燒死；使試管口沾染的少量菌得以燒死；H H、將燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸、將燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的菌體，然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將種的菌體，然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管（圖接種環(huán)抽出試管（圖5 5），注意盡量不要使環(huán)的部），注意盡量不要使環(huán)的部分碰釘子到管壁，取出后不可使環(huán)通過火焰；分碰釘子到管壁，取出后不可使環(huán)通過火焰；圖圖5 從一個試管移種到另一試管從一個試管移種到另一試管I I、迅速將接種環(huán)在火焰旁

9、伸進另一試管，在斜面、迅速將接種環(huán)在火焰旁伸進另一試管，在斜面培養(yǎng)基上從底部劃線到頂部，但不要把培養(yǎng)基劃破，培養(yǎng)基上從底部劃線到頂部，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種沾染管壁；也不要使菌種沾染管壁；J J、取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞、取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運到時灌塞上，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運到時灌入不潔的空氣，入不潔的空氣，K K、將接種環(huán)在火焰上再灼燒滅菌，放回原出后，、將接種環(huán)在火焰上再灼燒滅菌，放回原出后，再騰出手來將棉塞塞緊，將新接種的斜面試管放在再騰出手來將棉塞塞緊，將新接種的斜面試管放在試管架上；試管架上

10、；L L、接種后的斜面培養(yǎng)基，放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。、接種后的斜面培養(yǎng)基，放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。斜面接種示意圖斜面接種示意圖A、加熱融化培養(yǎng)基、加熱融化培養(yǎng)基 將三角瓶瓶口包扎繩解開，輕輕旋動棉塞，然后將瓶子將三角瓶瓶口包扎繩解開，輕輕旋動棉塞，然后將瓶子放入微波爐中加熱，選取高火力，加熱放入微波爐中加熱，選取高火力，加熱1min后取出晃動，后取出晃動，反復(fù)加熱直至培養(yǎng)基完全溶解。反復(fù)加熱直至培養(yǎng)基完全溶解。B、倒平板倒平板 右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后

11、左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。平置于桌面上，待凝后即為平板。 2）、平板接種）、平板接種技術(shù)技術(shù)接種方法：接種方法： A A 右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取培養(yǎng)物少右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取培養(yǎng)物少許。左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將許。左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（約占平板菌涂于瓊脂平板上端，

12、來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的總表面積的1/101/10），劃線時接種環(huán)與平板表面成），劃線時接種環(huán)與平板表面成30403040角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。 B B、燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細菌，待冷（是否冷卻，、燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線，約占平板表等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線，約占平板表面面1/51/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線以以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。 C C、劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽或臘筆、劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽或臘筆注明菌名檢驗號碼，接種者信息等，置注明菌名檢驗號碼，接種者信息等，置3737孵育培養(yǎng)孵育培養(yǎng)2424小時后觀察結(jié)果。小時后觀察結(jié)果。 劃線劃線接種接種目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，