蘇蕓金芽孢桿菌的腸毒素及其編碼基因的研究

1、蘇蕓金芽孢桿菌的腸毒素及其編碼基因的研究【摘要】目的對蘇蕓金芽孢桿菌(簡稱Bt )種群不同亞種存在的蠟狀芽孢桿菌腸毒素基因及溶血素BL進(jìn)行檢測，以便評估Bt對人類及高等動(dòng)物潛在的致病性。方法采用多重引物PCR技術(shù)，在同一PCR體系同時(shí)加兩對引物，hblA及bceT基因的擴(kuò)增片段分別為1017bp及427bp，與預(yù)期的完全一致；應(yīng)用HBL羊血平板，產(chǎn)溶血素BL的菌株可產(chǎn)生非連續(xù)型溶血環(huán)。結(jié)果45株Bt標(biāo)準(zhǔn)株中，29株含有hblA基因，占64.4%;15個(gè)生產(chǎn)用菌株及野生株中，含hblA基因的菌株為10株，占66.66%;含bceT基因的標(biāo)準(zhǔn)株29株，占64.4，含bceT的Bt生產(chǎn)用菌株及野生株

2、為13株，占86.6%。HBL羊血平板檢測結(jié)果表明：28.8%的Bt標(biāo)準(zhǔn)株及33.3%的Bt生產(chǎn)用菌株及野生株含溶血素BL。結(jié)論hblA及bceT基因在蘇蕓金芽孢桿菌中是普遍存在的，建議在遴選Bt生產(chǎn)菌株時(shí)，選用不含腸毒素基因或含腸毒素基因而不表達(dá)或表達(dá)水平不高的菌株。【主題詞】聚合酶鏈反應(yīng)芽孢桿菌，蘇蕓金芽孢桿菌，蠟狀腸毒素類基因 Study of the bceT and hblA genes and the hemolysin BL of Bacillus thuringiensis groupZhang Wencheng，Ren Gaixin. Department of Biolog

3、y Nankai University，Tianjin 300071【Abstract】ObjectiveThe hemolysin BL and the genes encoding enterotoxins have been examined in order to study the potential pathogenicity of Bt to mammals and human beings. MethodsMultiple polymerase chains reaction was performed to detect the hblA and bceT genes at

4、the same time,the amplified fragments were 1071bp and 427bp,respectively,as we expected.The HBL blood agar was used to detect the hemolysin-producing Bt strains. Results29 Bt type strains(64.4%) and 10 Bt commercial strains(66.6%) have the hblA gene; 29 Bt type strains(64.4%) and 13 Bt commercial st

5、rains(86.6%) have the bceT gene. Identification of hemolysin-producing Bt strains was conducted by the discontinuous hemolytic patterns on the HBL blood nutrient agar plates. 13 Bt type strains(28.8%) and 5 commercial strains(33.3%) produced the hemolysin BL. ConclusionsThe majority of Bt strains ha

6、ve hblA and bceT genes. In order to avoid the hazards to human beings, we suggest that the Bt strains which have no the two genes or the strains dont express the above genes can be used as the master strains for producing insecticides.【Subject words】Polymerase chain reactionBacillus thuringiensisEnt

7、erotoxin geneBacillus cereus由于蘇蕓金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)在其芽孢形成期可產(chǎn)生多種殺蟲晶體蛋白，目前已成為全球性應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌殺蟲劑。與其相反，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus,簡稱Bc)卻是人類的條件致病菌，它可引起敗血癥、心內(nèi)膜炎等非腸道感染1，但Bc對人類健康的主要威脅是造成食物中毒，Bc所造成的腹瀉型食物中毒是由其營養(yǎng)生長期產(chǎn)生的腸毒素所造成的。已闡明其結(jié)構(gòu)的腸毒素有兩種：一種是有三個(gè)亞基組成的具溶血活性的腸毒素，即溶血素BL(hemolysin BL),另一種是僅由一個(gè)亞基組成的腸毒素T(ente

8、rtoxin T)。溶血素BL三個(gè)亞基的編碼基因hblA、hblC、hblD已被克隆和測序2，3,日本學(xué)者Agata對腸毒素T的編碼基因bceT也進(jìn)行了克隆和測序。盡管Bt與Bc已被界定為不同的種，但新近的文獻(xiàn)資料表明，Bt與Bc的基因型及表現(xiàn)型非常相似。Carlson 1993年利用脈沖電場電泳(PFGE)及多位點(diǎn)酶電泳(MEE)對Bt與Bc染色體物理譜及多位點(diǎn)酶進(jìn)行了對比研究。結(jié)果表明，二者無實(shí)質(zhì)性差異，并主張將Bt與Bc鑒定為同一個(gè)種4。尤為引人注意的是，該文作者利用免疫試劑盒所檢測的12株Bt菌株中，有9株含有與Bc相似的腸毒素。1995年Damgaard的研究結(jié)果表明，用作殺蟲劑的B

9、t生產(chǎn)用菌株也可產(chǎn)生與Bc相似的腸毒素5。上述研究結(jié)果使人們開始關(guān)注是否Bt也可造成食物中毒？盡管文獻(xiàn)中僅有一例由Bt造成的人角膜潰瘍的報(bào)道6，但對于Bt對環(huán)境影響的研究變得日益迫切。為了認(rèn)識Bt對人類及高等動(dòng)物潛在的致病性，最直接的辦法是檢測Bt種群中不同亞種所含的腸毒素及其編碼基因。目前還沒有全面系統(tǒng)的相關(guān)報(bào)道，本研究首次全面系統(tǒng)地對Bt種群中腸毒素及其基因的分布進(jìn)行了檢測，并對Bt不同品系作為殺蟲劑的安全因素作出初步評價(jià)。材料與方法1.菌株的分離純化及H型鑒定：本實(shí)驗(yàn)使用的45個(gè)Bt標(biāo)準(zhǔn)株引自法國巴斯德研究所，15個(gè)Bt生產(chǎn)用菌株及野生株的分離純化、H型鑒定按常規(guī)進(jìn)行。產(chǎn)腸毒素的陽性參照

10、菌株Bacillus cereus 9633由中科院微生物所蔡妙英研究員惠贈(zèng)。2.腸毒素基因的PCR檢測(1)引物：hblA基因169-1126nt區(qū)段的上游引物為5?ACGAACAATGGAGATACGGC3?，下游引物為5?ATTTTTGTGGAGTAACAGTTTCTAC3?。bceT基因188-595nt區(qū)段的上游引物為5?TTACATTACCAGGACGTGCTT3?，下游引物為5? TGTTTGTGATTGTAATTCAGG3?。上述兩對引物參照文獻(xiàn)7。由中科院微生物學(xué)研究所合成。(2)模板的制備：將活化的Bt菌種接種于2YT平板，30培養(yǎng)至對數(shù)期，取一環(huán)(直徑為1.5mm)菌苔,

11、置于含100l無離子水的Eppendorf管中，用混勻器混勻。100沸水浴10分鐘，迅速冷卻，10000r/min離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管。-20保存?zhèn)溆谩?3)PCR體系：供試的PCR試劑皆購于華美公司，PCR體系總體積為50l:包括10buffer,5l;4dNTPs 4l;TaqDNA聚合酶1l(約1U)；上述兩對引物，41l,模板36l,覆蓋兩滴石蠟油，負(fù)對照體系不加模板，以無離子水代替。(4)PCR擴(kuò)增條件：FTS-320熱循環(huán)儀(Corbert Research,Australia),供試樣品在94變性3分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94變性40秒，55退火1分鐘，72延伸3

12、分鐘，最后72延伸10分鐘。(5)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：取20lPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Loading buffer(0.25%溴酚藍(lán)，40蔗糖水溶液)混合上樣，用0.8%瓊脂糖(含溴化乙錠0.5g/ml)凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳緩沖液為0.5TBE。電壓恒定于60V電泳120分鐘。紫外燈下觀察、照相。3.非連續(xù)性溶血環(huán)法檢測溶血素BL：參照Beecher8的方法略加改進(jìn)，制備HBL平板，補(bǔ)充0.15mol/L NaCl,高壓滅菌后，加小牛血清至5%，脫纖維羊血至8%。所有的血平板皆放于室溫下靜置24小時(shí)以上。將待測菌點(diǎn)接種于血平板上，28培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)后記錄結(jié)果，菌落周圍出現(xiàn)非連續(xù)型溶血環(huán)者為陽性

13、。結(jié)果PCR檢測hblA、bceT兩個(gè)基因在Bt不同菌株中的分布情況見表1、表2及1、2。羊血平板非連續(xù)型溶血環(huán)法檢測溶血素BL的結(jié)果見表1、表2及3。1Bt及Bc不同菌株P(guān)CR擴(kuò)增譜Fig1. PCR amplification patterns of Bt and BcLane 6:MW marker(Hind/EcoR digest)；Lane 5:Negtive control；Lane1-4:306, 7417, HD1, 96332四個(gè)Bt生產(chǎn)用菌株溶血素BL檢測結(jié)果示非連續(xù)型溶血環(huán)Fig2. The hemolytic patterns of Bt commercial stra

14、insA:9106; B:9203; C:9204; D:92073Bt生產(chǎn)用菌株hblA及bceT基因PCR擴(kuò)增譜Fig3. PCR amplification patterns of Bt commercial strainsLane16:MW marker( Hind/EcoR digest)；Lane15:Negative control；Lane 1-14:9510,9509,9503,9502,9501,9307,9304,9303,9207,9204,9203,9201,9106,V008表1Bt標(biāo)準(zhǔn)株中腸毒素基因及溶血素BL的檢測結(jié)果Table1.Detection of hb

15、lA,bceT genes and hemolysin BL of Bt type strains*Bt.serovarsH-serotypehblAbceTHemolysin BLthuringiensisE-0091+-+finitimus0212-kurstakiHD-733a3b+-HD-13a3b-+-dendrolimus3064a4b+-+V-0084a4b+-galleriae0015a5b+-+entomocidusE-0106+-+aizawai0967+-+morrisoniE-0128+-tolworthiE-0139+-darmstadiensis10+-touman

16、offi11a11b-+-thompsoni12+-pakistani13+-israelensis189714+-indiana16+-tohokuensis17+-kumamotoensis18a18b-+-tochigiensis19+-+yunnanensis11320a20b-+-colmeri21-+-shandongiensis22-+-japonensisT23 00123+neoleonensisT24 00124a24b+coreanensisT25 00125+-siloT26 00126-mexicanensisT27 00127-+-monterreyT28 0012

17、8a28b-amagiensisT29 00129+toguchiniT31 00131+camerounT32 00132+-leesisT33 00133+-konkukianT34 00134-seoulensisT35 00135-malaysiensisT36 00136-+-andalousiensisT37 00137+oswaldocruziT38 00138-+-brasiliensisT39 00139-huazhongensisT40 00140+sooncheonT41 00141+-+jinghongiensisT42 00142+-guiyangiensisT430

18、0143+-higoT44 00144+-roskildiensisT45 00145-*The source of Bt type strains H1-H9 was reported in the reference9,Type strain H20 was storaged in our laboratory and type strain H22 was originated from Beijing Institute of Zoology Academia Sinica.The rest were all obtained from Institute Pasteur,Paris,

19、France 表2Bt生產(chǎn)用菌株及野生株中hblA,bceT基因及溶血素BL的檢測結(jié)果Table2. Detection of hblA,bceT genes and hemolysin BL of Bt commercial and local strains*StrainsH-serotypehblAbceTHemolysinBLTrade mark or sourceskurstaki9503H3a3b+-Javalinkurstaki9501H3a3b-+-Biobitkurstaki9201H3a3b-Super starkurstaki9203H3a3b+Dipelkurstaki

20、9204H3a3b+Deflinkurstaki9509H3a3b+-Beijing Agriculure Universityaizawai9207H7+Centariaizawai9510H7+Centarisandiego9106H8a8b-+-Canadadendrelimus9303H4a4b+-Russiakurstaki9304H3a3b-+-Hubei Agriculture Science Institutedendrolimus9307H4a4b+-Cobell9502nd-Russiakenyae7404H4a4c+Microbiology Department of N

21、ankai Universitydendrolimus7417H4a4b+-Microbiology Department of Nankai University*nd:No determined1.hblA及bceT兩種基因在Bt中的分布：本實(shí)驗(yàn)對hblA及bceT兩種腸毒素基因在不同H型Bt標(biāo)準(zhǔn)株、野生株及不同生產(chǎn)用菌株中的分布情況作了全面系統(tǒng)的檢測。45個(gè)Bt標(biāo)準(zhǔn)株中有29株含有hblA基因，占64.4%;15個(gè)Bt生產(chǎn)用菌株及野生株中，含hblA基因的菌株為10株，占66.6%;含bceT的Bt標(biāo)準(zhǔn)株為29株，占總菌株的64.4%,含bceT基因的Bt生產(chǎn)用菌株有13株，占86.6%

22、。上述PCR檢測結(jié)果表明：hblA及bceT基因在Bt種群中是普遍存在的。2.溶血素BL在Bt不同亞種中的分布：利用非連續(xù)型溶血環(huán)法檢測的結(jié)果如下：45株Bt標(biāo)準(zhǔn)株中出現(xiàn)非連續(xù)型溶血環(huán)的菌株有13株，占28.8%。15個(gè)生產(chǎn)用菌株及野生株中有5株呈陽性，占33.3%。3.食物中毒致病株Bacillus cereus 9633的檢測結(jié)果：PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，造成腹瀉型食物中毒的病原菌株9633中僅含有bceT基因，非連續(xù)型溶血平板檢測結(jié)果表明，該菌株并未出現(xiàn)非連續(xù)型溶血環(huán)，說明其并不含有具溶血活性的腸毒素-溶血素BL。這與PCR未檢測到hblA基因的結(jié)果相符。討論本文中采用多重引物PCR技術(shù)(

23、multiple primer PCR),在同一個(gè)PCR體系同時(shí)加兩對引物，成功地從陽性對照菌株Bt dendrolimusV008及7417中擴(kuò)增到hblA及bceT的擴(kuò)增片段，擴(kuò)增片段的大小為1017bp及427bp,與預(yù)期的完全一致。利用兩個(gè)基因擴(kuò)增片段的大小差異，同時(shí)對兩個(gè)腸毒素基因在Bt菌株中的分布進(jìn)行了檢測，此法既經(jīng)濟(jì)又縮短了檢測時(shí)間。DNA模板制備采用直接煮沸法，操作難度小，從模板DNA的提取到得出結(jié)果可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，對PCR推廣應(yīng)用具有重要意義。為了增加引物與模板結(jié)合的特異性，實(shí)驗(yàn)中采用的退火溫度由原作者7的50提高到了55，所以擴(kuò)增的結(jié)果是可靠的。Bc菌落在血平板上的-溶血

24、現(xiàn)象是Bc的鑒別特征10,但是在常規(guī)的血平板上，溶血區(qū)帶是連續(xù)的，在菌落邊緣與溶血區(qū)的外緣之間沒有非溶血帶出現(xiàn)。而在改進(jìn)的HBL羊血平板上，含溶血素BL的Bc菌株周圍可產(chǎn)生特異的非連續(xù)型溶血環(huán)。目前用于檢測Bc腸毒素的各類試劑費(fèi)用高，專一性差。此研究所使用的方法費(fèi)用低廉、操作方便、可用于檢測大量標(biāo)本。Bt與Bc已被界定為不同的種，本研究中所使用的兩對引物的核苷酸序列是根據(jù)Bc菌株hblA及bceT基因的序列設(shè)計(jì)的，但在Bt菌株中擴(kuò)增到的序列與預(yù)計(jì)的完全一致。這為Bt與Bc在分子水平的相似性提供了新的證據(jù)。Carlson,CR 1996年11對Bt canadensisHD224與Bc ATCC

25、14579兩個(gè)菌株進(jìn)行染色體物理譜構(gòu)建及對比研究中發(fā)現(xiàn)，與hblA基因相似的序列在上述兩個(gè)菌株中皆有，但是，Bt canadensisHD224并未檢測到Bc樣腸毒素。這一結(jié)果與本文的研究結(jié)果相似，表1中Bt morrisoniE-012等15個(gè)Bt菌株含有hblA基因，但并未檢測到溶血素BL，很可能是這些菌株中的hblA基因并不表達(dá)。另一種可能是這些菌株不含有編碼溶血素BL其它兩個(gè)亞基的基因hblC、hblD，從而不能表達(dá)完整的溶血素BL。Granum PE 1996年對溶血素BL的B亞基編碼基因hblA在Bc中的分布進(jìn)行PCR檢測，239株病原菌株中，僅有127株含有hblA基因，占53%

26、。本研究共檢測了Bt標(biāo)準(zhǔn)株及生產(chǎn)用菌株和野生株60株，有40株含有hblA基因，占66.6%。可見hblA基因在Bt與Bc中是普遍存在的。就在我們進(jìn)行上述研究工作的同時(shí)，日本學(xué)者Asano S I從兩個(gè)Bt標(biāo)準(zhǔn)株(Bt israelensis,Bt sotto)及一個(gè)Bc菌株(Bc FM1)中,克隆了另一種新的腸毒素基因entI,entS,及entFM12。比較兩Bt標(biāo)準(zhǔn)株中腸毒素基因的編碼蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)entS及entI的相似性為99%,而Bt sotto與Bc FM1的腸毒素的相似性為97%。可見為了比較Bt與Bc致病性的差異。除了檢測腸毒素基因的分布之外。有必要對腸毒素基因進(jìn)行克

27、隆和測序。用Bt生產(chǎn)的各種商品化殺蟲劑已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用于農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲防治數(shù)十年，與Bc不同的是，Bt危及人類健康的報(bào)道很少，有如下兩種可能：(1)Bt與Bc腸毒素的蛋白中氨基酸序列的細(xì)微差異，可以降低含腸毒素Bt菌株的致病性。(2)Bt菌株在人胃及小腸中不能繁殖。盡管如此，為了避免Bt造成生態(tài)污染并對人類健康及其它動(dòng)物構(gòu)成威脅，建議在遴選Bt高毒生產(chǎn)株及生物工程改良菌株的出發(fā)株時(shí)，選用不含腸毒素基因，或含有腸毒素基因而不進(jìn)行表達(dá)及表達(dá)水平不高的Bt菌株。 本課題受國家自然科學(xué)基金資助，項(xiàng)目號：39470002作者單位：300071 天津，南開大學(xué)生物系參考文獻(xiàn)1李振堂，孫風(fēng)英.蠟狀芽孢桿菌敗血

28、癥死亡一例.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1994,9(2)120.2Heinrich JH,Beecher DJ,Macmilliam JD,et al.Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the component of hemolysin BL from Bc.J Bacteriol,1993，1756760-6766.3Pyan PA,Macmilliam JD,Zilin K.Molecular cloning and characterization of the gene encoding the

29、L1 and L2 components of hemolysin BL from Bc.J Bacteriol,1997,1792551-2556.4Carlson CR,Kolsto AB.A comoplete physical map of Bt chromosome.J Bacteriol,1993,1751053-1060.5Damgaard PH.Diarrhoeal enterotoxin production by strains of Bacillusthuringiensis from commercial Bacillusthuringiesis-based insecticide.FEMS Immun Med Microbiol,1995,12245-250.6Sample JR & Buntter T.C