液相色譜質(zhì)譜法定量測定食品中的丙烯酰胺

1、液相色譜/質(zhì)譜法定量測定食品中的丙烯酰胺楊金萍 天津市東麗區(qū)衛(wèi)生防病站 李明元天津市衛(wèi)生防病中心采用簡單且費(fèi)用低廉的液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)方法定量測定各種食品中的丙烯酰胺(AA)。設(shè)備：LC/MS系統(tǒng)本試驗(yàn)是通過帶有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧探針的四極微型質(zhì)譜平臺(tái)LCZ(Micromass UK有限公司,Cheshire， UK)完成的，LC系統(tǒng)為Waters Alliance 2690系列,LC分析柱為 YMC ODS-AQTM,5m，120A,2.0mm×150mm(Waters公司,Milford,MA)。SPE萃取柱Sep-Pak® Plus C18(Waters公司,022

2、515)。均質(zhì)器-Tekmar TissumizerTM(SDT-1810)或Ultra-Turrax® (T18 Basic)。試劑：ACS級(jí)二氯乙烯(對(duì)人類可能的致癌物，使用時(shí)應(yīng)通風(fēng)及采用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)施)。甲酸(88%純度)和丙烯酰胺(AA含量大于99.9%)-Omni-Pur®，EM Science公司產(chǎn)品(Gibbstown,NJ)。高純度乙酸乙酯和乙腈BurdickJackson(Muskegon,MI)。ACS級(jí)無水硫酸鈉-Ultra Resi-Analyzed® (12-60目),Mallinckrodt Baker有限公司產(chǎn)品(Phillips

3、burg,NJ)。同位素標(biāo)記的丙烯酰胺(1-13C-AA,99%)CDN Isotopes公司產(chǎn)品(Pointe-Claire,Quebec)。乙酸銨-Sigma Ultra,含量大于98%,Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品(St.Louis,MO)。LC流動(dòng)相10mmol乙酸銨的水溶液，以甲酸調(diào)節(jié)pH至4.6。水用實(shí)驗(yàn)室Millipore系統(tǒng)產(chǎn)生的電阻系數(shù)(R)大于10M/cm的水。標(biāo)準(zhǔn)：以乙酸乙酯配制如下濃度的校準(zhǔn)標(biāo)液：0,0.25,0.75,1.5,3.0,及5.0ng/L的丙烯酰胺(每一標(biāo)準(zhǔn)含有4.5ng/L13C-AA)。對(duì)于低含量樣品(10-100ppb)，以乙酸乙酯配制成0,1

4、0,50,100pg/L的丙烯酰胺(每一標(biāo)液含有450pg/L13C-AA)。樣品制備與提?。簩⒑稚俚氖澄锛耙恍┦焓持破啡珩R鈴薯片、玉米餅碎片、面包、蘑菇及油炸漢堡包放入食品處理機(jī)前處理30s，直至食物顆粒直徑在3mm左右，即食馬鈴薯制品不必進(jìn)行前處理。將蘆筍等蔬菜切碎。稱取前處理后的食物樣品6.00±0.01g放入125mL錐形瓶中，加入12µg 13C-AA（低AA含量食品加入1.2µg 13C-AA），然后，加入去離子蒸餾水（40mL），將錐形瓶置于65水浴中30min。加二氯乙烯（10 mL）至錐形瓶中，然后放在組織均質(zhì)器上均質(zhì)30s。取25g均質(zhì)樣品

5、于容量30mL離心管中，以2700×g離心30min，吸取8g上清液至另一離心管，加入10mL乙酸乙酯，加蓋，震蕩10s。將上層液體轉(zhuǎn)移至20 mL比色管中，水層用5 mL乙酸乙酯再提取2次，合并提取液至比色管中。向比色管中加入2g無水硫酸鈉以吸去提取液中的水分，然后將提取液放入65水浴以N2吹至1 mL。將1 mL提取液轉(zhuǎn)移至Pierce REACTI-VIALTM中進(jìn)一步濃縮至100-200L（避免液體揮干而導(dǎo)致回收率降低），將最后的提取液置于2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶中?？救狻⒖Х确奂翱煽煞鄣臉悠分苽洌嚎救?、咖啡粉及可可粉的樣品制備方法基本同上。所不同的是取6mL上清液通過Sep-Pa

6、k Plus C18萃取柱并經(jīng)0.45m注射器過濾器過濾后再用乙酸乙酯提取。萃取柱使用前先用3mL乙腈及6mL去離子蒸餾水活化，流出液經(jīng)注射器過濾器過濾后用乙酸乙酯提取，其方法同上。在最后100-200L提取液中有時(shí)會(huì)形成沉淀物，去除沉淀物，將剩余的提取液轉(zhuǎn)移至另一比色管中備用。LC/MS分析：流動(dòng)相流速為200L/min（恒流），樣品進(jìn)樣體積為5.0L。LC/MS分析以正離子電噴霧方式進(jìn)行，N2用于干燥氣（650L/h，250）。離子源溫度保持在130，毛細(xì)管電壓為3.81kV，錐孔電壓15V，提取器電壓4V，射頻透鏡0.38V，離子能量0.3V。選擇離子監(jiān)測方式監(jiān)測AA及13C-AA的m/

7、z分別為72和73M+H+。離子停留時(shí)間為0.5s。分析約50個(gè)樣品后建議采用如下方法對(duì)分析柱進(jìn)行凈化：用5%乙腈水溶液沖洗分析柱30-40min，然后重新以流動(dòng)相平衡柱子。校正：以響應(yīng)值比率（AA峰面積/13C-AA峰面積）對(duì)相應(yīng)的濃度比率作校準(zhǔn)曲線，濃度比率可根據(jù)校準(zhǔn)曲線由響應(yīng)值比率計(jì)算出來，濃度比率乘以已知的13C-AA含量即為AA的含量（ppm）。有代表性的校準(zhǔn)曲線為：Rr=0.9420RC+0.01728，r=0.99981，Rr是響應(yīng)值比率，RC為濃度比率。計(jì)算方法如下：測得AA峰面積（m/z72）：9970測得13C -AA峰面積（m/z73）：66655響應(yīng)值比率Rr=0.1496，根據(jù)校準(zhǔn)曲線的斜率和截距，計(jì)算出濃度比率：RC=（0.1496-0.01728）/0.9420=0.1405樣品中添加的13C AA量為2.18ppm，AA含量為0.1405×2.18=0.306ppm或306ppb.方法的定量限為10ppb；校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r>0.998；11種不同食物的加標(biāo)回收率結(jié)果滿意；以馬鈴薯測得試驗(yàn)的精密度為5-8%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）。在現(xiàn)行的LC/MS/MS