調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化中脂代謝的小RNA

1、調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化中脂代謝的小RNA摘要：最近miR- 33a/ b被發(fā)現(xiàn)是代謝包括膽固醇和脂肪酸穩(wěn)態(tài)關鍵調(diào)節(jié)劑。這些內(nèi)含子小RNA被嵌入固醇響應元件結(jié)合蛋白基因， SREBF2和SREBF1，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子，協(xié)調(diào)膽固醇和脂肪酸的合成。通過抑制多種參與膽固醇流出和脂肪酸氧化的基因，包括ABCA1 ， CROT ， CPT1 ， HADHB和PRKAA1，miR- 33a/b與宿主基因一起以提高細胞甾醇水平。最近在動物模型中的研究表明，抑制這些小的非編碼RNA的對脂蛋白代謝的有較強的影響，包括提高血漿HDL（高密度脂蛋白）和減少VLDL(極低密度脂蛋白)甘油三酯。此外，其他的小分子RNA被發(fā)現(xiàn)，

2、也針對ABCA1途徑，其中包括miR- 758 ，表明miRNA可以協(xié)同工作來規(guī)范這一途徑。這些令人振奮的研究結(jié)果支持microRNA拮抗劑的發(fā)展為治療血脂異常，動脈粥樣硬化及相關代謝性疾病提供了潛在的治療方法。小RNA的發(fā)現(xiàn)及其在人類基因表達調(diào)控中的作用是在過去十年中最激動人心的科學突破。這些短（22個核苷酸）非編碼RNA通過序列特異性雜交與信使RNA 3非編碼區(qū)（ 3UTRs）的靶標位點互補來抑制基因的表達。通過改變mRNA的穩(wěn)定性和/或抑制mRNA的翻譯，小RNA表現(xiàn)出在另一個層面之上控制轉(zhuǎn)錄的微調(diào)，并顯著改變細胞行為。因為最初他們在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的miRNA，超過700miRNA已

3、經(jīng)在人類基因組中確定的，并且預測超過三分之一的人類基因通過這些小RNA進行調(diào)節(jié)。許多這些miRNA在跨物種中是高度保守的，突出作為調(diào)節(jié)基因表達的這些分子進化的重要性。單個的miRNA可以同時調(diào)節(jié)多個靶基因的表達，從而提供了一種機制，以調(diào)節(jié)基因的整個網(wǎng)絡。至今，小RNA已被證實在許多生物過程中起到了不可或缺的作用，包括免疫應答，發(fā)育，干細胞分化和最近的脂代謝。最近我們和其他工作團體定義了兩種基因內(nèi)miRNA，代表了內(nèi)固醇響應元件結(jié)合蛋白的基因SREBF2和SREBF1 ，是代謝途徑的關鍵調(diào)節(jié)。SREBF2和SREBF1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子， SREBP1和SREBP2 ，在調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝中

4、的角色是公認的。然而，發(fā)現(xiàn)miR- 33a和miR- 33b嵌入在這些基因中出現(xiàn)一個明顯的反饋桐廬，需要的時候可以推動細胞內(nèi)脂肪酸和膽固醇水平。根據(jù)啟動SREBPs轉(zhuǎn)錄的條件，miR 33a/ b與宿主基因共表達和往復調(diào)節(jié)基因參與膽固醇的流出/ HDL合成（ ABCA1 ， ABCG1和NPC1 ），脂肪酸氧化（ HADHB ， CROT ， CPT1A ），和極低密度脂蛋白甘油三酯代謝（ AMPKa ， SREBP -1）。這些基因的調(diào)控元件共同努力，從而微調(diào)細胞中膽固醇和脂肪酸的水平。雖然2004年報道了miR- 33a的基因組位置，但直到2010年，這個位置的功能和意義一系列平行研究才建

5、立。采用基因芯片篩選方法，雷納等人鑒定的miR- 33a為巨噬細胞20種microRNA的一種并表明其平行表達的SREBF2改變細胞內(nèi)膽固醇含量。其他兩個團隊，納杰菲舒什塔利等人與馬夸特等人，通過在硅片srebf基因的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了miR 33。每一項研究證實，在固醇耗竭條件下，mir-33a與宿主基因共同轉(zhuǎn)錄REBF2。所有三個團隊指出，目標預測算法放在一個非常有趣的潛在的候選的miR- 33的靶基因的列表的頂部：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運ABCA1負責游離膽固醇從細胞移出和新生的HDL顆粒的生成。這個發(fā)現(xiàn)強調(diào)了miR - 33在調(diào)節(jié)膽固醇平衡方面潛在的重要性。的確， ABCA1的3UTR包含三

6、個高度保守的結(jié)合位點miR- 33a和/或miR- 33b和ABCA1 mRNA的表達位點和多種細胞類型的miR -33的過表達使蛋白質(zhì)的表達強烈受抑制，尤其是肝細胞。盡管ABCA1對肝的作用本質(zhì)上是其對HDL的生物作用，在巨噬細胞中ABCA1的表達用于輸送過量的膽固醇出小區(qū)的臨界稱為反向膽固醇運輸?shù)姆椒?。miR- 33的過表達在巨噬細胞中被發(fā)現(xiàn)，以減少ABCA1的表達，從而抑制載脂蛋白A介導膽固醇的流出。相反，抑制巨噬細胞中的內(nèi)源性的miR- 33的增加和ABCA1表達，增強脂質(zhì)巨噬細胞膽固醇流出，凸顯這一途徑中miR- 33的生理重要性。除了控制ABCA1的表達，我們小組確定了miR- 3

7、3控制涉及細胞中膽固醇運輸?shù)膬蓚€其他蛋白質(zhì)：ABCG1 ，其釋放膽固醇轉(zhuǎn)向HDL；NPC1 ，其輸送膽固醇從溶酶體區(qū)室向細胞其它有此需要的的部分。鼠的ABCG1基因的3UTR含有兩個的miR- 33結(jié)合位點，但這些位點在人的3UTR不保守。在小鼠細胞，但不是人類起源的巨噬細胞中miR- 33過表達證實了miR -33抑制ABCG1表達，說明這種基因受miR - 33的種屬特異性調(diào)控。小鼠來源的ABCG1細胞靶向的功能結(jié)果證明了miR- 33過表達后減少了膽固醇流出到HDL。此外，人類NPC1的3UTR含有兩個的miR- 33結(jié)合位點，從而導致在人巨噬細胞和肝細胞NPC1蛋白表達受miR -33

8、的抑制。NPC1與ABCA1一致行動使膽固醇流出到載脂蛋白A1 ，這表明了在人類細胞中的第二部分miR -33的抑制膽固醇的流出途徑。這些研究突出了一個單一的miRNA如何同時控制同一途徑的數(shù)個基因，以協(xié)調(diào)地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。miR - 33 / SREBF / ABCA1軸的識別簡潔的例證的本質(zhì)是介導miRNA的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)。然而，早期的研究最初只關注miR- 33a而對miR- 33b卻很少知道。值得注意的是，miR- 33a的進化過程是高度保守的，而的miR- 33b只存在于中型和大型哺乳動物SREBF1基因中。雖然miR- 33a和b之間19個核苷酸的成熟形式有兩個不同，但它們具有

9、相同的關鍵序列（核苷酸1至8或2至9） ，用于定位和功能的最關鍵序列。生物信息學分析預測miR- 33a和的miR- 33b很大程度上抑制基因的同一個子集，迄今為止，一直沒有發(fā)現(xiàn)目標基因受miR - 33a和miR- 33b共同抑制。然而，由于這些微小RNA與宿主基因是共轉(zhuǎn)錄的，所述的miR- 33a的和b的相對含量是有可能通過SREBF2和SREBF1誘導條件來調(diào)節(jié)的 ，并且因此可以是完全不同的。有趣的是， SREBF2 mRNA在肝臟中的相對含量是顯著小于SREBF1 （10） ;它將被預測的miR- 33a的含量是比miR- 33b的含量低。此外，在影響SREBF1轉(zhuǎn)錄中升高的條件下，如

10、高胰島素血癥中，miR- 33b的水平，也顯著地增加，并預測可顯著地影響它的靶基因。事實上，代謝綜合征包括高血漿胰島素水平和高密度脂蛋白循環(huán)低 - 可能部分原因是由于肝增加轉(zhuǎn)錄SREBF1 /miR- 33b和導致ABCA1表達減少。而這種假設仍然在人中進行測試，它是一種miRNA可在生理和病理狀態(tài)產(chǎn)生深刻影響的實例。miR- 33抑制動物模型中高密度脂蛋白膽固醇的增加通過體內(nèi)遞送的miR-模擬小RNA的選擇性調(diào)制（雙鏈寡核苷酸替換微RNA的功能）或抗miR的（單鏈寡核苷酸抑制劑）允許的miRNA功能和生理意義的調(diào)查。在小鼠體內(nèi)這些研究已經(jīng)顯示miR- 33a的使用變構(gòu)的反義寡核苷酸 ，病毒引

11、起的抑制劑，增加肝細胞ABCA1表達和高密度脂蛋白循環(huán)近40%。這些研究中證實在生理上miR- 33調(diào)節(jié)在小鼠中的HDL循環(huán)水平是至關重要的，并建立了miR- 33的抑制作為靶向治療的可能性，升高HDL和為動脈粥樣硬化提供保護。這些miR- 33拮抗作用研究的結(jié)果通過最近敲除小鼠的miR- 33基因來證實的。小鼠SREBF2內(nèi)含子miR- 33a的靶向缺失對存活力或生育力沒有影響，而定位策略的使用不破壞SREBP2功能。miR- 33缺陷的小鼠血漿HDL膽固醇水平比野生型C57BL / 6的小鼠高25 至40。出人意料的是，而對雄性和雌性小鼠來說，高密度脂蛋白的含量沒有差異，但使用miR -

12、33的藥物抑制劑，據(jù)報道m(xù)iR- 33基因敲除雌性小鼠與雄性小鼠相比，在血漿HDL上有較大升幅。這種差異的分子機制目前尚不清楚，但指出可能是miR -33在雄性和雌性的生物學潛力不一樣。由于高密度脂蛋白的靜態(tài)測量推斷其功能具有先天的局限性，以進行驗證，增加HDL膽固醇有很重要功能性后果。越來越多的證據(jù)表明，血漿HDL的絕對水平比這高密度脂蛋白促進膽固醇的去除能力去外圍組織的重要性低（如動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞）以廢物排泄的過程被稱為反向膽固醇運輸。使用體內(nèi)測定法來測量膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的效率，雷納等人發(fā)現(xiàn)，miR -33的功能是抑制產(chǎn)生的高密度脂蛋白和增加的細胞的放射性標記的膽固醇運輸?shù)窖獫{，肝

13、臟和排泄物。值得注意的是，高密度脂蛋白的動脈保護特性被保留在抗miR -33處理的小鼠中，尤其是其促進巨噬細胞的膽固醇流出和以保護細胞因子引起的炎癥的內(nèi)皮細胞的能力。這些研究表明了miR -33的抑制可能對動脈粥樣硬化是一個有希望的治療方法。在動脈粥樣硬化的小鼠模型中，載脂蛋白A1的過度表達來提高HDL已經(jīng)顯示出妨礙斑塊進展和促進回落。此外，在載脂蛋白E缺陷小鼠中直接注入高密度脂蛋白，膽固醇喂養(yǎng)的兔子，或人類受試者的既定的動脈粥樣硬化斑塊的減少尺寸。同樣，在小鼠建立動脈粥樣硬化，miR- 33的抑制產(chǎn)生了動脈粥樣硬化病變的明顯消退，這是在于噬斑尺寸特征的減小，脂質(zhì)和巨噬細胞含量減小過渡到更穩(wěn)定

14、的斑塊型。值得注意的是，抗miR -33寡核苷酸，侵入巨噬細胞動脈粥樣硬化斑塊，直接增加ABCA1的表達，有可能增加這些細胞膽固醇流出和降低整體斑塊膽固醇含量。此外，通過巨噬細胞分離出的牙菌斑基因表達分析，激光捕獲顯微切割表明在炎癥基因表達量的降低。因此，抗miR -33治療的好處是雙重的：它增加了肝ABCA1表達，高密度脂蛋白循環(huán)和反向膽固醇運輸，以及增加巨噬細胞的膽固醇斑塊的流出，從而結(jié)果是損傷回歸和過渡到一個更穩(wěn)定的表型。miR- 33對小鼠脂肪酸代謝抑制的影響有趣的是，果蠅miR- 33a具有一個高度保守的成熟形式，但這些生物都不能合成類固醇。這個發(fā)現(xiàn)指出，miR -33有更廣泛的作用

15、，并引起了miR- 33a/b對額外的目標的識別。Guerin等人和達瓦洛斯等人證明，除了參與膽固醇轉(zhuǎn)運靶向基因中，miR- 33還控制涉及脂肪酸氧化途徑的基因。肝細胞中miR- 33的過表達下調(diào)CPT1A ， CROT，HADHB和PRKAA1的表達，（AMP Kinase ; AMPK1 ） ，降低脂肪酸的氧化并增加甘油三酯積聚。重要的是，抑制內(nèi)源性的miR- 33導致CPT1A ， CROT和HADHB的低表達，并增加脂肪酸氧化。這些研究擴大我們對miR - 33在調(diào)控生物脂質(zhì)平衡中的理解，并表明了miR - 33有重要影響，超越了其作為一個高密度脂蛋白的調(diào)節(jié)作用。在非人類的靈長類動物的

16、研究而這些早期在小鼠的研究強調(diào)了的miR - 33抑制治療提高血漿高密度脂蛋白，這些研究結(jié)果外推到人類是復雜的，事實上，小鼠缺乏mir-33b。雖然在嚙齒類動物mir-33b是不存在的，在非人靈長類動物這型的miR - 33的存在也有助于在人類高度相關的模型中的高密度脂蛋白和脂肪酸的代謝調(diào)控來研究SREBF1基因。全身植入的抗miR -33寡核苷酸設計為同時抑制miR- 33a和miR- 33b，12周內(nèi)非洲綠猴肝在增加ABCA1基因的表達而誘導的血漿HDL持續(xù)增加。在這個模型中，miR- 33的抑制，8周后誘導最大密度脂蛋白增加50 ，這是持續(xù)在整個研究中。值得注意的是， miR- 33的拮

17、抗作用在該非人類靈長類動物模型中也顯著的降低了血漿甘油三酯。在4周這種減少是明顯的，研究結(jié)束時減少到最大值的50。血漿脂蛋白的分級顯示，這是來自于降低VLDL-相關聯(lián)的甘油三酯，主要是新近從肝臟分泌的大的VLDL顆粒。經(jīng)處理的猴的肝基因表達分析表明，抗miR -33增加ABCA1 mRNA和蛋白的表達，以及脂肪酸氧化途徑中 CPT1A ， CROT和HADHB是關鍵成員。此外，抗miR -33處理12周后，也有 SREBP- 1的mRNA和蛋白水平的顯著降低。脂肪酸合成的關鍵調(diào)節(jié)劑和宿主基因miR- 33b的減少，是令人吃驚的，它沒有的miR- 33的直接靶向目標。然而，進一步的分析表明，增加

18、肝表達AMPK1（由PRKAA1編碼），這是SREBP- 1途徑的負調(diào)節(jié)物，也的miR- 33的直接靶向。值得注意的是，除了SREBP- 1降低，抗miR -33處理過的猴的肝臟顯示在參與脂肪酸合成這種轉(zhuǎn)錄因子的下游，包括脂肪酸合酶（ FASN ） ， ATP檸檬酸裂解酶和乙酰輔酶A羧化酶的關鍵基因的表達的減少。因此，通過經(jīng)由HADHB ， CPT1A和CROT的去抑制同時增加脂肪酸氧化，并且通過抑制的SREBP- 1途徑降低脂肪酸合成（ SREBF1 ， FASN ， ACLY ， ACACA ） ， 抗miR -33處理導致血漿VLDL甘油三酯顯著減少。這些研究結(jié)果表明了在小鼠中研究miR

19、- 33的局限性，因為miR- 33b和AMPK1的3UTR的靶位點只存在于高等哺乳動物中。這一突破性的研究建立在高度相關的人體模型中，即的miR- 33a和b的藥理學抑制是一種很有前途的治療策略，以提高血漿HDL和降低VLDL和血脂異常的治療，降低心血管疾病的風險。低HDL ，高VLDL甘油三酯通常與代謝綜合征相關，miR- 33抑制劑可能為這一日益嚴重的健康問題的處理具有臨床實用。值得注意的是，在小鼠和猴， miR- 33的抑制也增加肝表達IRS2，胰島素信號傳導的關鍵組分，在代謝綜合征中也變得不正常。miR 33a/b過表達降低IRS2水平并抑制下游信使級聯(lián)活化，包括AKT。此外，miR

20、- 33a/b還針對FSR2已建議通過召集Src同源磷酸酶2 （ SHP2 ）參與胰島素信號和RS2相似分子以用作對接。研究迄今所用的動物模型的血糖正常，未來的研究，以充分理解的miR- 33對胰島素信號傳導和糖尿病的影響是重要的。其它調(diào)節(jié)脂代謝的miRNAmiR-758除了與miR- 33 ，最近的一項研究確定的miR- 758作為ABCA1的第二個靶microRNA。就像miR- 33，miR- 758抑制人類和小鼠巨噬細胞ABCA1的表達，降低細胞內(nèi)膽固醇流出到載脂蛋白A1。此外，miR- 758在肝臟中高表達，并且顯示出調(diào)節(jié)ABCA1的表達，在人類和小鼠的肝細胞中miR- 758的過表

21、達 ，這表明它可能在調(diào)節(jié)HDL中發(fā)揮生物作用。不同于miR- 33，miR- 758是一種基因間的miRNA ，介導其調(diào)控的因素在很大程度上是未知的。根據(jù)其在調(diào)節(jié)ABCA1中的角色，miR- 758的作用是下調(diào)巨噬細胞和從高膽固醇飼料喂養(yǎng)的小鼠之后大多數(shù)組織的膽固醇負荷。因此， miR- 33和miR- 758可協(xié)作以下調(diào)膽固醇耗竭條件下的ABCA1 ，然而存在于細胞ABCA1 3UTR的開頭的三個miR- 33結(jié)合位點表明，這種的miR可能與靶向ABCA1有較高的療效?？傊?，這些研究結(jié)果表明， ABCA1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表達可能涉及幾種不同的miRNA以及miRNA各自的生理意義的將通過其相對的

22、組織表達來確定。值得注意的是，有一種miR- 758比miR- 33更高表達的組織是大腦。ABCA1在大腦中的水平已顯示出具有負相關淀粉樣蛋白的負載，ABCA1基因靶向治療正在積極地研究在阿爾茨海默病。在大腦中， ABCA1釋放膽固醇流向載脂蛋白E，這是腦在阿爾茨海默病上已建立的遺傳風險因素的主要膽固醇載體。在阿爾茨海默氏病的小鼠模型中， ABCA1基因缺陷加劇淀粉狀蛋白，而過量的ABCA1可改善淀粉樣蛋白負荷，暗示對ABCA1中A的代謝起關鍵作用。因此，操縱miRNA靶向ABCA1 ，如miR- 33和miR- 758，可能是阿爾茨海默氏病以及急性腦損傷的潛在治療方式，其中載脂蛋白E促進神經(jīng)

23、元的恢復。miR-122膽固醇代謝也已發(fā)現(xiàn)被廣泛地受肝臟中最豐富的miRNA，miR -122 調(diào)節(jié)。miR- 122占肝臟總miRNA的表達的70 ，并與肝臟代謝的調(diào)節(jié)以及丙型肝炎病毒感染和肝細胞癌（ HCC）相關聯(lián)。在體內(nèi)miR- 122的靶向抑制策略揭示這個微小RNA與肝相關的生理。miR- 122在小鼠中沉默，導致了同時在LDL和HDL的級分觀察到血漿總膽固醇持續(xù)降低?；虮磉_陣列分析表明，miR- 122的抑制，下調(diào)牽連肝代謝的幾個基因和肝細胞產(chǎn)生的增加數(shù)百個基因通常被抑制表達，這表明這個微小RNA在維持肝表型具有重要的作用。此外，沉默高脂肪喂養(yǎng)的小鼠miR- 122,將其聯(lián)系到一個

24、脂肪酸氧化的還原和刺激膽固醇的合成,降低脂肪肝。這些結(jié)果與miR -122控制FASN ， ACC1和ACC2表達-參與脂肪酸合成和氧化的所有基因的觀察結(jié)果一致。隨后LNAantagomirs在非人類靈長類動物針對的miR- 122的研究表明，與所觀察到的小鼠相似，miR -122在非洲綠猴和黑猩猩中沉默引起總血漿膽固醇的大幅度減少，范圍從20%至30 ，而在肝臟沒有明顯的毒性或病理變化。除了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中，miR- 122已顯示出在丙型肝炎病毒基因組的5的非編碼區(qū)結(jié)合，并且這種結(jié)合在肝細胞中病毒積累和傳播感染是必需的。值得注意的是，HCV感染的非人類靈長類動物，miR- 122的沉默導致HC

25、V病毒血癥持續(xù)降低和改善肝病理學，沒有證據(jù)表明具有病毒抗性。在這些非人類靈長類動物的研究的安全性和抗miR122的功能證明Miravirsen的進步，臨床試驗針對miR- 122與miRNA基因靶向治療。第一階段在健康受試者中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果， Miravirsen具有很好耐受性，提供基于miRNA的治療的進步是治療慢性疾病?？偨Y(jié)脂質(zhì)代謝和動脈粥樣硬化領域的miRNA的研究還處于起步階段，因此，充分發(fā)現(xiàn)在這個研究領域具有巨大機遇。miR- 33a和b嵌入在SREBP基因，以及它們的活化的負反饋環(huán)路，可以幫助調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的發(fā)現(xiàn)，已大大提高了我們對控制脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)機制的理解。同時，這些開創(chuàng)性的研究已經(jīng)擴大到我們發(fā)現(xiàn)進行可類似地調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝其他的潛在的miRNA。盡管最佳的藥物治療，以降低低密度脂蛋白膽固醇，血管疾病仍然是西方國家死亡的主要原因。通過輸送miRmimics到目標體內(nèi)微小RNA ，以提高微RNA功能，或抗miR的抑制微RNA的能力，為治療血脂異常的發(fā)展開辟了新的途徑，并提供了獨特的方法，通過調(diào)節(jié)整個生物途徑來治療疾病。圖1肝臟中miR- 33的靶向蛋白質(zhì)同時參與多種代謝途徑miR-33a/b肝中表達，細胞的ABCA1減少，導