第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Content of Table一、一、PCRPCR的定義的定義二、二、PCRPCR技術(shù)的優(yōu)點技術(shù)的優(yōu)點三、三、PCRPCR原理原理四、四、PCRPCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系五、五、PCRPCR反應(yīng)五要素反應(yīng)五要素六、六、PCRPCR類型及應(yīng)用類型及應(yīng)用一、一、PCRPCR的定義的定義 在引物指導(dǎo)下由酶催化的在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定克隆或基因組對特定克隆或基因組DNADNA序列序列進行的體外擴增反應(yīng)。進行的體外擴增反應(yīng)。HomeHome 二、二、PCRPCR技術(shù)的優(yōu)點技術(shù)的優(yōu)點特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等

2、性好、易自動化等能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNADNA片段片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍HomeHome三、三、PCRPCR原理原理Sample1. denaturatation2. Primer annealing3. Primer extensionRegion to be copiedPCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55左右，引物與模板DNA單鏈的

3、互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。 1234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上D

4、NA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增

5、第5輪擴增第6輪擴增PCR productPCR productTarget AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconPCR儀四、四、PCRPCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

6、的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系10擴增緩沖液擴增緩沖液 10l 4種種dNTP混合物混合物 各各200mol/L 引物引物 10100 pmol 模板模板2g Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5 ul （Mg2+） 1.5 mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ulHomeHome五、五、PCRPCR反應(yīng)五要素反應(yīng)五要素引物引物 （primerprimer）酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （templatetemplate） MgMg2

7、+ 2+ （magnesiummagnesium）六、PCR的類型及應(yīng)用1、 PCR的類型反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)：RNA的反轉(zhuǎn)錄與PCR的聯(lián)合應(yīng)用原位PCR技術(shù)：在細(xì)胞內(nèi)進行，不需要提取DNA實時PCR技術(shù)：進行DNA的定量分析筑巢筑巢PCR PCR 彩色彩色PCR PCR 多重多重PCR PCR 不對稱不對稱PCR PCR 共享引物共享引物PCR PCR 差異顯示差異顯示PCR PCR 錨定錨定PCR PCR 重組重組PCRPCR2、 PCR的應(yīng)用研究 -基因克隆、測序、分析突變診斷 -細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測、診斷人類基因組工程 -遺傳圖譜的構(gòu)建、測序、表達圖譜法醫(yī) -犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤檢測其他法醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)個人識別、親子鑒定1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進行個人