微生物的實驗室培養(yǎng)授課

1、微生物的實驗室培養(yǎng)授課微生物的類群微生物的類群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌單細胞的動植物單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等如草履蟲、單細胞藻類等無細胞結(jié)構(gòu)無細胞結(jié)構(gòu)真核細胞真核細胞細菌、藍藻細菌、藍藻原核細胞原核細胞課題1 微生物的實驗室培養(yǎng)一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽碳源碳源無機碳源：無機碳源：有機碳源：有機碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉

2、膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源氮源無機氮源：無機氮源：有機氮源：有機氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -（為硝化細菌提供（為硝化細菌提供N N源和能源）源和能源）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含CHONCHON的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽2.2.特殊營養(yǎng)：特殊營養(yǎng)：維生素、堿基等（生長因子）維生素、堿基等（生長因子）（牛肉膏

3、、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧氣的需求：、氧氣的需求：4.4.種類：種類：固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無有無 凝固劑瓊脂凝固劑瓊脂分離分離 鑒定鑒定工業(yè)工業(yè) 生產(chǎn)生產(chǎn)化學成分：化學成分：物理性質(zhì)：物理性質(zhì)：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0

4、g分析營養(yǎng)構(gòu)成？分析營養(yǎng)構(gòu)成？5. 5. 配制原則配制原則目的明確：目的明確：營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當適宜的適宜的pHpH值：值：有機碳源有機碳源異養(yǎng)型：異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：自養(yǎng)型： 不加碳源不加碳源加入緩沖劑加入緩沖劑細菌偏堿，真菌偏酸細菌偏堿，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生產(chǎn)生產(chǎn)科研科研耐高溫需保持干燥的耐高溫需保持干燥的 物品，物品，160170 12小時小時接種環(huán)、接種針等接種環(huán)、接種針等 金屬用具金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒滅菌滅菌定義定

5、義方法方法較為溫和理化方法，較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，強烈的理化方法，殺死所有微生物殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化學藥劑化學藥劑紫外線紫外線灼燒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，100KPa、121、1530min二二. .無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染防止外來雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或

6、滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手2.2.無菌范圍：無菌范圍：實驗操作空間消毒實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗用具滅菌實驗操作過程實驗操作過程二二. .無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染防止外來雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：酒精燈旁操作酒精燈旁操作超凈工作臺超凈工作臺有些細菌在一定的條件下，細胞里面有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形

7、的休眠體，叫做芽孢。形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸有的細菌的芽孢，煮沸3 3小時以后才死小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌菌細菌、原生動物、真菌和植細菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細胞。能直接發(fā)育成的生殖細胞。能直接發(fā)育成新個

8、體。新個體。 單個單個或少數(shù)菌體或少數(shù)菌體2.2.特征：特征：大小、形狀、光澤度、大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。顏色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定義：定義：菌落菌落鑒定菌種的重要依據(jù)鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基上大量繁殖大量繁殖子細胞群體子細胞群體1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g三三. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.計算：計算：培養(yǎng)基用量培養(yǎng)基用量依配方

9、計算各成分的用量依配方計算各成分的用量2.2.稱量：稱量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解、少量水加熱溶解 取紙取紙蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl瓊脂瓊脂 補水定容補水定容4.4.調(diào)調(diào)pHpH、分裝、封口：、分裝、封口：5.5.滅菌：滅菌：6.6.倒平板：倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細胞分散成單個細胞, ,形成單個菌落形成單個菌落約約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，灼燒滅菌，防

10、止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？基的溫度？ 答：答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。時，就可以進行倒平板了。2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。生物污染培養(yǎng)基。3.3.平

11、板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空

12、氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。培養(yǎng)微生物。二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：平板劃線法：平板劃線法：菌種菌種劃劃3 3個平板個平板1 1個不劃線個不劃線1.1.純化大腸桿菌的方法：純化大腸桿菌的方法：平板劃線法平板劃線法和稀釋涂布平板法和稀釋涂布平板法接種環(huán)接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基防止劃破培養(yǎng)基（重復實驗）（重復實驗）（空白對照）（空白對照） 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培

13、養(yǎng)基表平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。1 1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在

14、的微生物污染培養(yǎng)物可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。減少，以便得到菌落。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。環(huán)境和感染操作者。 2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：以免接種環(huán)溫度太

15、高，殺死菌種。 3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時，在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。的菌落。6 6支試管，分別加入支試管，分別加入9ml9ml無菌水無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051

16、ml106稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器浸浸稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超過不超過各梯度分別涂布各梯度分別涂布3個平板個平板1 1個不涂布作空白對照個不涂布作空白對照滴滴灼灼涂涂稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍 稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋，稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。

17、 涂布平板的所有操作都應在火焰附近涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應如何進行無步應如何進行無菌操作？菌操作？應從操作的各個細節(jié)保證應從操作的各個細節(jié)保證“無菌無菌”。例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、 吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。吸管要在酒精燈火焰周圍等等。3平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點適用范圍適用范圍平板劃線平板劃線分離法分離法可以觀察

18、菌落特可以觀察菌落特征，對混合菌進征，對混合菌進行分離行分離不能計數(shù)不能計數(shù)適用于好氧菌適用于好氧菌稀釋涂布稀釋涂布平板法平板法可以計數(shù)，可以可以計數(shù)，可以觀察菌落特征觀察菌落特征吸收量較少、吸收量較少、較麻煩，平板較麻煩，平板不干燥效果不不干燥效果不好，容易蔓延好，容易蔓延適用于厭氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌和兼性厭氧菌四、課題成果評價四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，