利用 SYBR-GreenI染料和DyNAzymesII聚合酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定

1、利用 SYBR-GreenI染料和DyNAzymesII聚合酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定    摘要nbsp;本研究對(duì)噬菌體和人類基因組nbsp;DNAnbsp;進(jìn)行定量，擴(kuò)增反應(yīng)使用nbsp;DyNAzymesIInbsp;聚合酶，檢測(cè)使用nbsp;SYBR-GreenInbsp;染料。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了起始拷貝數(shù)范圍為nbsp;10nbsp;2nbsp;至nbsp;10nbsp;8nbsp;的噬菌nbsp;     Mimi Amutan and David Batey, Ph.D. 摘要 本研究對(duì)噬菌體和人類基因組

2、DNA 進(jìn)行定量，擴(kuò)增反應(yīng)使用 DyNAzymesII 聚合酶，檢測(cè)使用 SYBR-GreenI 染料。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了起始拷貝數(shù)范圍為 10 2 至 10 8 的噬菌體 DNA 和起始拷貝數(shù)范圍為 75 至 7.5x10 4 的人類基因組 DNA 。噬菌體 DNA 模板四個(gè)重復(fù)樣品 C(t) 標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 0.3 個(gè)循環(huán)說明了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)證明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SYBR-GreenI 染料對(duì)基因組定量是準(zhǔn)確而可靠的。 簡(jiǎn)介 使用實(shí)時(shí)定量方法有效的對(duì)生物樣品中的 DNA 和 RNA 定量。定量的試劑包括與 DNA 雙鏈結(jié)合的熒光染料和 TaqMan 探針、分子信標(biāo)等特異性

3、的雜交探針。與 DNA 雙鏈結(jié)合 SYBR-GreenI(SG ) 染料因使用簡(jiǎn)單而被許多定量實(shí)驗(yàn)采用。 SG 是一種特異結(jié)合雙鏈 DNA 的染料，已被證明能靈敏的檢測(cè)核酸。 SG 結(jié)合雙鏈 DNA 后熒光增強(qiáng) 1000 倍左右，極為適合檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。由于 SG 能結(jié)合于所有雙鏈，因而不能特異性的檢測(cè)某一特定模板。使用雜交探針要求細(xì)心設(shè)計(jì)引物組，而 SG 僅需要兩個(gè)用于擴(kuò)增的引物，無需對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。 DyNAzymesII 聚合酶在多種擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生了很好的結(jié)果。這種由 Thermus brockianus 中分離出來的聚合酶比 Taq 酶熱穩(wěn)定性更好，能在廣泛的反應(yīng)條件下保持很好的

4、活性。 SG 對(duì) DyNAzymesII 聚合酶的抑制作用更小。本研究的實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果表明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SG 能夠精確靈敏的檢測(cè)到噬菌體和人類基因組 DNA 的初始濃度。 方法 DyNAzyme II DNA 聚合酶購(gòu)于 Finnzymes (F-503L) 。 SG 和 噬菌 DNA 購(gòu)于 Molecular Probes (S-7567, P-7589); 人基因組 DNA 購(gòu)于 Sigma (D-3160). 反應(yīng)液加入低緣微孔板 (MJ Research MLL-9651) 或八連管 (MJ Research TLS-0251) ，用超凈管蓋封閉 (M

5、J Research TCS-0803) ，反應(yīng)體系如表 1 所示。    SG 原液通常為高濃度 (e.g.10,000X). 表中使用的 SG 為 10X SG ， OD 值在 495nm 為 0.4+0.01O.D. 。 SG 用 0.1X TE 緩沖液稀釋至 10X 工作液。 擴(kuò)增 噬菌體 DNA 的引物序列如下（擴(kuò)增產(chǎn)物 100bp ）： 正向引物： 5-GCA-AGT-ATC-GTT-TCC-ACC-GT-3, 反向引物： 5-TTA-TAA-GTC-TAA-TGA-AGA-CAA-ATC-CC-3 擴(kuò)增人類基因組中 -actin 基因的引物

6、如下（擴(kuò)增產(chǎn)物 294bp ）： 正向引物： 5-TCA-CCCACA-CTG-TGC-CCA-TCT-ACG-A-3 反向引物： 5-CAG-CGGAAC-CGC-TCA-TTG-CCA-ATG-G-3 反應(yīng)液混合后將反應(yīng)管或反應(yīng)板放入定量 PCR 儀中，按照表 2 所列的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。    閾值線設(shè)定為最初的 3 7 個(gè)循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。這一閾值自動(dòng)的應(yīng)用于所有的孔，使得在該點(diǎn)處對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品比較產(chǎn)生一致的結(jié)果。在任何實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的閾值線設(shè)定相同十分關(guān)鍵。 以 0.5g/ L 噬菌體 基因組 DNA 為母液制備濃度梯度樣品

7、。在 20 L 的反應(yīng)體系中分別加入 1 L 各稀釋度的樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用來源于人類胎盤的人基因組 DNA 制備濃度梯度樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 結(jié)果 1 噬菌體 基因組 DNA 模板：線性范圍與重復(fù)性 將熒光信號(hào)對(duì)循環(huán)數(shù)作圖 (Figure 1a) 表明每一個(gè)樣品中雙鏈 DNA 的濃度都升高到了背景熒光水平之上，并且都進(jìn)入了指數(shù)擴(kuò)增期。 C(t) 值（熒光曲線與域值線交叉的點(diǎn)）隨著初始模板濃度的增加而成比例的減少，這是因?yàn)槌跏寄０鍧舛雀叩臉悠犯斓纳勺阋员?SG 檢測(cè)到的數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。 噬菌體 基因組 DNA 初始模板拷貝數(shù)的線性范圍從 10 2 到 10 8 ， 起始模板濃度的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)

8、的 C(t) 值成正比。 Figure 1b 展示的是 100bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物 起始模板濃度的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng) C(t) 值的關(guān)系圖，回歸系數(shù)為 0.991 ，表明了極強(qiáng)的線性關(guān)系。 對(duì)每一個(gè)濃度的樣品，我們都做了四個(gè)重復(fù)，通過計(jì)算 C(t) 值的差異來驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。如 Table 3 中所示，重復(fù)樣品間 C(t) 的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 0.3 。    Figure 2 顯示了 10 4 拷貝的 噬菌體 DNA 四個(gè)重復(fù)樣品的熔解曲線。隨著溫度的升高與雙鏈接連結(jié)合的 SG 釋放，熒光信號(hào)也隨之平滑的下降。熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)也被顯示。熒光強(qiáng)度變化的拐

9、點(diǎn)（熔點(diǎn)， Tm ）處清晰地看到了一個(gè)單一的峰，大約是在 82°C 。這個(gè)峰對(duì)應(yīng)著擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖中 沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和假陽(yáng)性現(xiàn)象。    2 人基因組 DNA 模板：使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)患者樣品定量 Figure 3 是由人類基因組 DNA 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線， 起始拷貝數(shù)范圍為 75 至 7.5x10 4 ，回歸系數(shù) r 2 =0.993 。同時(shí)檢測(cè)了兩位患者的基因組 DNA 樣品。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，第一位患者樣品的初始拷貝數(shù)濃度為 254co

10、pies/ L , 第二位患者樣品的初始拷貝數(shù)濃度為 357copies/ L .    PCR 產(chǎn)物的特異性通過兩種方法確定。第一種方法為熔解曲線分析，例如，患者樣品 1 的熔解曲線分析顯示在 88.5°C 時(shí)有一個(gè)單一的峰，表明特異的擴(kuò)增了 -actin ，如 Figure 4 所示。第二種方法是通過凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物。如 Figure 5 所示每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都僅有一個(gè)電泳條帶，表明了除了少量引物二聚體外，特異性的擴(kuò)增到目的產(chǎn)物。    討論 1 對(duì)于 噬菌體 基因組和人基因組 DNA 都

11、有很寬的線性范圍 使用 DyNAzyme II DNA 聚合酶和 SYBR Green I 染料可以成功地對(duì)小基因組和復(fù)雜的人類基因組進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)表明至少 6 個(gè)數(shù)量級(jí)的 噬菌體 基因組 DNA 和至少 3 個(gè)數(shù)量級(jí)的人基因組 DNA 的起始模板濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的 C(t) 值曲線圖顯示出很好的線性關(guān)系。檢測(cè)線性范圍廣的特點(diǎn)使其在檢測(cè)未知濃度的 DNA 樣品和濃度范圍廣泛的樣品時(shí)極具價(jià)值。 本研究中，標(biāo)準(zhǔn)品的下限分別是： 噬菌體 基因組 DNA100 拷貝， 基因組 DNA75 拷貝。其他的研究中得到過保持線性關(guān)系的更低的下限濃度。對(duì)于一些需要檢測(cè)到幾個(gè)拷貝模板量的實(shí)驗(yàn)，例如分析很少的細(xì)胞數(shù)

12、量或者痕量 DNA 樣品，較高的靈敏度無疑有著重要的意義。 2 本方法適用于很多應(yīng)用實(shí)例 本文的實(shí)驗(yàn)方法可以參考用于很多實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然也需要根據(jù)具體的要求和條件進(jìn)行修改。因?yàn)?SYBR Green I 可以使雙鏈 DNA 更穩(wěn)定，為了確保解鏈完全，可以將變性溫度提高 2 。此外，最好利用溫度梯度摸索最佳退火溫度，可以借助熔解曲線分析和凝膠電泳來評(píng)價(jià)目的擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。 3 DMSO 本文的實(shí)驗(yàn)方法可用于分析多種樣品。用 -actin 的引物擴(kuò)增人類基因組 DNA 在 擴(kuò)增的純度和方便性方面都是一個(gè)極好的例子。而通過添加 DMSO 等方法優(yōu)化反應(yīng)條件可以幫助擴(kuò)增難于擴(kuò)增的模板。 DMSO(

13、二甲亞楓 ) 是一種助解鏈劑，對(duì)于一些以二級(jí)結(jié)構(gòu)較強(qiáng)的 DNA 為模板進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)而言， DMSO 能降低擴(kuò)增產(chǎn)物的變性溫度。 DMSO 的濃度低于 5 （ v/v ）時(shí)都能產(chǎn)生較好的效果。但在反應(yīng)體系中添加 DMSO 時(shí)需格外小心，因?yàn)?DMSO 減弱雙鏈 DNA 穩(wěn)定性的作用會(huì)使結(jié)合于雙鏈 DNA 的 SG 減少，從而降低熒光信號(hào)。添加 DMSO 也會(huì)同時(shí)降低擴(kuò)增產(chǎn)物和引物的 Tm 值。 建議實(shí)驗(yàn)中逐漸增加 DMSO 的量以摸索最適用量。 4 讀板溫度的選擇可以增加特異性 熔解曲線可以用來分析產(chǎn)物，以消除引物二聚體等副反應(yīng)產(chǎn)物的影響。為了消除引物二聚體對(duì) C(t) 值的影響，每個(gè)循環(huán)中的

14、讀板溫度被調(diào)高到了 78 ，這一溫度高于引物二聚體的 Tm 值。在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結(jié)合的 SG ，從而消除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號(hào)。在這一溫度下較長(zhǎng)的 PCR 產(chǎn)物仍保持復(fù)性狀態(tài)，其數(shù)量直接反映于熒光強(qiáng)度。讀板溫度通常設(shè)為比特異產(chǎn)物 Tm 值低 3 。通過分析熔解曲線數(shù)據(jù)可以確定產(chǎn)物和引物二聚體的熔解溫度。 這里討論的結(jié)果表明 DyNAzymesII 聚合酶在使用 SYBR-GreenI 染料實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中具有很好的效果。本文列出的方法對(duì)于 噬菌體 基因組 DNA 和人基因組 DNA ，都能在較寬的線性范圍內(nèi)得到精確、可重復(fù)的定量結(jié)果。在使用 SYBR-G

15、reenI 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化變性、退火溫度，考慮使用 DMSO ，選擇合適的讀板溫度，是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一些基本方法。 參考文獻(xiàn)   Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. (2000) Journal of Mol Endocrinology 25 ,169-193.   Gibson, U.E., Heid, C.A. and Williams, P.M. A nov

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