大孔吸附樹脂分離純化草珊瑚總黃酮的工藝研究

1、【摘要】 目的研究大孔吸附樹脂分離純化草珊瑚總黃酮工藝，為草珊瑚總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以貴州產(chǎn)草珊瑚為原料，以草珊瑚總黃酮含量及回收率等為考察指標(biāo)，選用大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮進(jìn)行分離純化，分別采用靜態(tài)試驗(yàn)、動(dòng)態(tài)試驗(yàn)等考察大孔樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的分離純化效果及影響因素。結(jié)果AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮靜態(tài)飽和吸附量為116.25 mgg-1（干樹脂），洗脫率92.9%，動(dòng)態(tài)飽和吸附量為94.5 mgg-1（干樹脂），總黃酮回收率在96.1%、純度在90%以上，是實(shí)驗(yàn)樹脂中分離純化草珊瑚總黃酮的最佳大孔吸附樹脂。結(jié)論分離純化草珊瑚總黃酮最佳工藝條件為：AB-8型大孔吸附樹

2、脂，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3倍樹脂體積，流速34 ml/min，上柱總黃酮量與樹脂比為110.5，上柱液總黃酮濃度為19.8 mg/ml，流速23 ml/min，沖洗雜質(zhì)用水體積23 BV，上柱液pH值45。 【關(guān)鍵詞】 大孔樹脂 草珊瑚 總黃酮 分離 純化Abstract:Objective A method for separation and purification of the flavonoids from Sarcandrae glabra with macroporous resin was studied.MethodsBy using Sarcandrae gla

3、bra in Guizhou and with the content and recovery rate of flavonoids as indexes and the static absorption capacity and the static elution ratio were observed. ResultsThe results were as flollows: The static absorption capacity of AB-8 type resin was 116.25 mgg-1, the static elution ratio was 92.9%, t

4、he dynamic absorption capacity of AB-8 type resin was 94.5 mgg-1, the recovery rate was more than 96.1% and the purity was more than 90%. AB-8 type resin was the best for separating and purificating Sarcandrae glabra in flavonoids.ConclusionThe optimum conditions is: AB-8 type macroporous resin, the

5、 eluant is 70% alcohol and 3 times as the volume of the resin, the volume of the resin is 10.5 times of flavonoids in sample, concentration of flavonoids of sample is 19.8 mgml-1 and current velocity of 23 mlmin-1, pH value of sample is 45.Key words:Macroporous resin； Sarcandrae glabra； Flavonoids；

6、Separation； Purification 草珊瑚Sarcandra glabra ( Thunb. ) Nakai為多年生常綠草本或亞灌木，系金粟蘭科草珊瑚屬植物，藥用全草。在我國長江以南各省均有分布，特別是云、貴、川較為多見。草珊瑚葉苦辛、性溫、有小毒，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血祛淤、止血止痛、接骨續(xù)筋之功效，民間常用來治療風(fēng)濕痹癥，跌打損傷等1及作茶飲用，已有數(shù)百年的歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)，藥理、毒理研究表明草珊瑚具有抗菌消炎，抑制多種病原菌，清熱解毒，抗多種腫瘤，促進(jìn)骨折愈合，改善血液循環(huán)，鎮(zhèn)痛，抗疲勞，抗氧化，抑制流感病毒等多種生物活性2。毒性實(shí)驗(yàn)表明草珊瑚及其提取物無毒；動(dòng)物精子畸性實(shí)驗(yàn)，小鼠

7、骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)等均為陰性，未發(fā)現(xiàn)致突變作用，所以是非常安全的3，4。目前，草珊瑚的加工產(chǎn)品有醫(yī)藥、獸藥品，保健品，食用品等數(shù)十種之多。黃酮類化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的藥用有效成分之一2。隨著草珊瑚在醫(yī)藥、獸藥、保健食品及保健用品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，而對(duì)草珊瑚總黃酮的分離純化研究尚未見到系統(tǒng)報(bào)道。為了更合理地開發(fā)利用草珊瑚資源，本研究以草珊瑚總黃酮含量及回收率等為考察指標(biāo)，選用大孔吸附樹脂分離純化草珊瑚總黃酮，分別采用靜態(tài)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)等考察大孔樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的分離純化效果及影響因素，研究分離純化草珊瑚總黃酮的最佳工藝條件及各種影響因素。從而為生產(chǎn)中最有效的開發(fā)利用草珊瑚、發(fā)揮

8、草珊瑚的最大經(jīng)濟(jì)效益提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與儀器 草珊瑚全草均采自貴州省江口縣同一地點(diǎn)，由本院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定及采用統(tǒng)一的干燥方法加工制樣，避免背景干擾。 所用試劑NaNO2，Al(NO3)3，NaHSO3，NaSO3，EDTA，吐溫-80等均為分析純，乙醇為95%食用酒精，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為美國Sigma公司產(chǎn)品、含量大于98%；大孔吸附樹脂： D3520型，AB-8型，NKA-9型，D4020型，S-8型（南開大學(xué)化工廠）。 TU-1800紫外可見分光光度計(jì)（北京普析），RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），不銹鋼提取鍋（武漢立中），PHSJ3F精密酸度計(jì)（上海雷磁），ALG5/10自動(dòng)灌裝

9、封口機(jī)（上海國彩），電子天平（美國奧豪斯），恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)；鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；植株樣本粉碎機(jī)(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；液體自動(dòng)混合機(jī)（北京長安儀器廠）。2 方法與結(jié)果2.1 草珊瑚總黃酮的測定方法草珊瑚總黃酮的測定方法采用蘆丁比色法5，測定波長500 nm，回歸方程：C=84.317A-0.77361，(r=0.999 8)，吸光度線性范圍：0.10.6，加樣回收的平均回收率99.37%，RSD=1.85%（n=6）；精密度測定RSD=0.95%。2.2 草珊瑚總黃酮純化用樣品液的制備取草珊瑚全草（除根）干品粗粉500 g，根據(jù)作者已有試驗(yàn)L9（34）正交設(shè)計(jì)篩選出的草珊瑚

10、總黃酮乙醇浸提最優(yōu)水平組合工藝：即采用60%乙醇、80溫度，3 h/次，提取3次進(jìn)行提取制備，制得草珊瑚總黃酮提取液（總黃酮含量：9.5 mgml-1）冷藏備用。2.3 大孔吸附樹脂的篩選68將D3520型、AB-8型、NKA-9型、D4020型、S-8型樹脂先用4倍體積量95%乙醇或丙酮浸洗均可，至浸洗液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時(shí)止，用水反復(fù)清洗干凈至無醇味或無酮味，加入4倍體積量2 molL-1的氫氧化鈉溶液，浸泡12 h，以水洗至中性；再加入4倍體積量4 molL-1的鹽酸，浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性后60烘干備用。 精密稱取經(jīng)上述預(yù)處理的干樹脂1 g共3份，置100 ml三角瓶中

11、，精密加入2.2項(xiàng)下制取的樣品液20 ml后震蕩吸附，頻率120次/min，1分鐘間隔振蕩2 h，然后靜置20 h，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層液測定總黃酮濃度，按下式計(jì)算樹脂飽和吸附量：飽和吸附量=（初始濃度-吸附后濃度）吸附液體積/樹脂量（mgg-1干樹脂），取三次平均值。將經(jīng)靜態(tài)飽和吸附總黃酮后樹脂濾出，吸干表面水分，精密加入60%濃度的乙醇20 ml后同上法震蕩2 h后濾出，測定洗脫液總黃酮的濃度，計(jì)算洗脫率：洗脫率=洗脫液濃度洗脫液體積/飽和吸附量100%，取3次平均值。結(jié)果見表1。表1 5種樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的靜態(tài)飽和吸附洗脫結(jié)果（略） 上述結(jié)果表明5種大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的靜

12、態(tài)飽和吸附量均在90 mg以上，以AB-8型樹脂靜態(tài)吸附量最大；在靜態(tài)洗脫中，AB-8型樹脂洗脫率為92.9%，高于其它4種，AB-8型樹脂表現(xiàn)出最佳的綜合性能。2.4 洗脫劑濃度的篩選精密稱取預(yù)處理好的AB-8型干樹脂1 g共7份，分別置100 ml三角瓶中，精密加入2.2項(xiàng)下制取的樣品液20 ml后按2.3項(xiàng)下同法震蕩，使其達(dá)到飽和吸附，分離樹脂，吸干表面水分。對(duì)應(yīng)加入濃度分別為30%，40%，60%，70%，70%，80%，90%的乙醇各20 ml后同法震蕩洗脫2 h后過濾出，測定洗脫液總黃酮濃度，計(jì)算洗脫率（算法見2.3項(xiàng)下）。結(jié)果見表2及圖1。表2 乙醇濃度對(duì)AB-8型樹脂洗脫率的影

13、響 （略） 表2表明, 洗脫劑乙醇濃度增高，洗脫率逐漸增大，70%90%的乙醇洗脫率均在90%以上，而乙醇濃度高易揮發(fā)，從經(jīng)濟(jì)、安全、節(jié)約出發(fā)本實(shí)驗(yàn)選用70%乙醇為洗脫劑。2.5 pH對(duì)AB-8型樹脂吸附量的影響精密稱取已預(yù)處理好的干樹脂1 g共8份，各置100 ml三角瓶中，精密加入pH3，4，5，6，7，8，9，10樣品液各20 ml按2.3項(xiàng)下同法震蕩，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層液測定總黃酮濃度，按2.3項(xiàng)下公式計(jì)算樹脂飽和吸附量。結(jié)果見表3及圖2。表3 pH對(duì)AB-8型樹脂飽和吸附量的影響（略） 表3表明，上樣液以pH4飽和吸附量最大。2.6 AB-8型樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附-洗

14、脫量測定稱取已處理好的AB-8型吸附樹脂100 g和20 g，分別濕法裝入3 cm500 cm的色譜柱中，將2.2項(xiàng)下制取的草珊瑚提取液330 ml（9.5 mgml-1）以23 mlmin-1的流速上柱，過柱完后用3倍樹脂體積量（3BV，下同）的蒸餾水以34 mlmin-1的速度洗柱至洗脫液無色，再用4BV 70%的乙醇以23 mlmin-1的洗脫速度洗脫至無色透明，收集70%的乙醇洗脫液，按2.1項(xiàng)下方法測定總黃酮含量，計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附洗脫量，總黃酮回收率等（回收率過柱后總黃酮質(zhì)量/過柱前總黃酮質(zhì)量100%）。結(jié)果見表4。表4 AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫結(jié)果（略） 表

15、4表明，裝柱量為100 g的色譜柱總黃酮回收率為96.13%，表明已吸附完全，而每克樹脂吸附量為30.3mg，未達(dá)飽和。裝柱量為20 g的色譜柱總黃酮回收率為60.97%，表明未吸附完全，而每克樹脂吸附量為94.5 mg，吸附量已達(dá)飽和。其吸附量94.5 mgg-1（干樹脂）即為AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮的飽和動(dòng)態(tài)吸附-洗脫量。- The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of longan necleuses. It has

16、 a brilliant prospect in developing this natural resources.【參考文獻(xiàn)】 1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production technology question and answerM. G

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