大鼠促甲狀腺激素TSH酶聯(lián)免疫分析

1、大鼠促甲狀腺激素（ TSH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關液體樣本中促甲狀腺激素（TSH）的含量。實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠促甲狀腺激素（TSH ）水平。用純化的大鼠促甲狀腺激素（TSH）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入促甲狀腺激素（ TSH ），再與 HRP 標記的促甲狀腺激素（TSH ）抗體結合，形成抗體-抗原 -酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的促甲狀腺激素（TSH ）呈正相

2、關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），通過標準曲線計算樣品中大鼠促甲狀腺激素（ TSH ）濃度。試劑盒組成 ：試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存說明書1 份1 份封板膜2 片（ 48）2 片（ 96）密封袋1 個1 個酶標包被板1× 481× 962-8保存標準品： 1350IU/L0.5ml × 1 瓶0.5ml × 1 瓶2-8保存標準品稀釋液1.5ml × 1 瓶1.5ml × 1 瓶2-8保存酶標試劑3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存樣品稀釋液3 ml ×

3、 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 A液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 B液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存終止液3ml× 1 瓶6ml × 1 瓶2-8保存濃縮洗滌液（ 20ml× 20 倍）× 1 瓶（20ml ×30 倍）× 1 瓶2-8保存樣本處理及要求：1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。2. 血漿：應根據(jù)

4、標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離

5、心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?2-8的溫度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于 -20保存，但應避免反復凍融 .7. 不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物

6、酶的（ HRP）活性。操作步驟：1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品 100l，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 棄掉，再各取 50l 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50l，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別

7、加標準品稀釋液 50l，混勻后從第九第十孔中各取50l 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為 900IU/L ， 600IU/L ， 300IU/L ，150IU/L ，75IU/L ）。2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將 30（ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（ 48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。5

8、.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。11.測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（液后 15 分鐘以內進行。OD值）。 測定應在加終止注意事項：1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密

9、封袋中保存。2 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（× n× 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物請避光保存。7 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準8 所有樣品，洗滌液和各種

10、廢棄物都應按傳染物處理。9 本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。.計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。（此圖僅供參考）試劑盒性能：1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R 值為 0.990 以上。2.批內與批見應分別小于9%和 11%檢測范圍：50IU/L -1000 IU/L保存條件及有效期：1.試劑盒保存：； 2-8。2有效期：

11、 6 個月RDRat thyroid-stimulating hormoneFOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGeneric Name： Rat thyroid-stimulating hormone (TSH) ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of TSH concentrations in Rat serum, blood plasma, and other biological fluids.Principle of the assayThe kit assay Rat TSH le

12、vel in the sample，use Purified Rat TSH antibodyto coatmicrotiterplate wells, make solid-phaseantibody,then add TSH to wells, CombinedTSHantibody which With HRP labeled, become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, afterwashing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue

13、 color At HRPenzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and thecolor change is measured spectrophotometricallyat a wavelength of 450 nm. Theconcentration of TSH in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samplesto the standard curve.Mate

14、rials provided with the kitMaterials provided with48determinations96 determinationsStoragethe kitUser manual11Closure plate membrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8Standard0.5ml 1×bottle0.5ml 1×bottle2-8： 1350 IU/LStandard diluent1.5ml 1×bottle1.5ml 1×bottle2-8HRP-Conjug

15、ate reagent3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8Sample diluent3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8Chromogen Solution A3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8Chromogen Solution B3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8Stop Solution3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8（ 20ml × 20fold（ 20ml× 30fo

16、ldwash solution）2-8×1× 1bottlebottleSpecimen requirements1. serum- coagulation at room temperature 10-20，2.3.4. （PH7.2-7.）5. Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add（PBSPH7.2-7.4） , Rapidly frozen with liquid nitrogen, maintain samples at2-8after melting,add PBS（PH7.4）6.

17、 extract as soon as possible after Specimen collection,andaccordingto the relevant literature,and shouldbe experimentas soon as possibleafter the extraction.If it cant, specimen can be kept in -20 to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.7. Can t detect the sample which containNaN3, because Na

18、N3 inhibits HRP active.Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, addStandard 100 l to the first and the second well, then add Standard50dilutiontothe first andthe second well, mix; take out 100 l form the first and the second well then add

19、it to the thiand the forth well separately.then add Standarddilution 50tol the third and the forthwell ,mix ; then take out 50 l from the third and the forth well discard, add 50the sixth well ,then add Standard dilution50 l to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50from the fifth and the si

20、xth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standarddilution50 l to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50 l from the seveneighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard 50dilutionto the ninth andthe tenth well, mix , take out 50 m the ninthandlfrothe

21、 tenth welldiscard(add Sample 50 l toeach well after Diluting ,(density:75IU/L)900IU/L ， 600IU/L ，300IU/L ， 150IU/L ，2.add sample：Set blank wells separately (blank comparisonwells donaddt sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution40

22、tol testing samplewell, then add testing sample10(samplelfinal dilution is5-fold), add sample to wellsdon, t touch the well wall as far as possible,andGently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30min. at 374.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solut

23、ion diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50 l to each well, exceptblank well.7

24、.incubate： Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade thelight preservation for 15 min at3710.Stopthe reaction： Add Stop Solution50lto each well, Stop the reaction(theblue color change to yellow color).11.assay：take

25、blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution andwithin 15min.Important notes1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes in the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in

26、Sealed bag.2. washingbuffer will Crystallizationseparation,it can be heated the water helps dissolve when dilute . Washing does not affect the result.3. add Samplewith samplerEach step, And proofreadits accuracyfrequently,avoids the experimentalerror. add sample within 5 mins, if the number of sampl

27、e is much , recommend to use Volley .4. if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the first standard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor（. ×n×5）.5. Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6. The substrate evade the light preserv