分子發(fā)光分析法

1、第五章分子發(fā)光分析法基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時，便產(chǎn)生分子發(fā)光 (Molecular Luminescence)。依據(jù)激發(fā)的模式不同，分子發(fā)光分為光致發(fā)光、熱致發(fā)光、場致發(fā)光和化學(xué)發(fā)光等。光致發(fā)光按激發(fā)態(tài)的類型又可分為熒光和磷光兩種。本章討論分子熒光(Molecular Fluorescence)、分子磷光 (Molecular Phosphorescence)和化學(xué)發(fā)光 (Chemiluminescence)分析法。第一節(jié)熒光分析法一、概述分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進行定性，以熒光強度進行定量的一種分析方法。早在 16

2、 世紀，人們觀察到當紫外和可見光照射到某些物質(zhì)時。這些物質(zhì)就會發(fā)出各種顏色和不同強度的光，而當照射停止時，物質(zhì)的發(fā)光也隨之很快消失。到 1852 年才由斯托克斯(Stokes)給予了解釋，即它是物質(zhì)在吸收了光能后發(fā)射出的分子熒光。斯托克斯在對熒光強度與濃度之間的關(guān)系進行研究的基礎(chǔ)上，于1864 年提出可將熒光作為一種分析手段。1867 年Goppelsroder 應(yīng)用鋁桑色素絡(luò)合物的熒光對鋁進行了測定。進入 20 世紀，隨著熒光分析儀器的問世， 熒光分析的方法和技術(shù)得到了極大發(fā)展， 如今已成為一種重要且有效的光譜分析手段。熒光分析法的最大優(yōu)點是靈敏度高，它的檢出限通常比分光光度法低 24 個數(shù)

3、量級，選擇性也較分光光度法好。雖然能產(chǎn)生強熒光的化合物相對較少，熒光分析法的應(yīng)用不如分光光度法廣泛，但由于它的高靈敏度以及許多重要的生物物質(zhì)都具有熒光性質(zhì)。使得該方法在藥物、臨床、環(huán)境、食品的微量、痕量分析以及生命科學(xué)研究各個領(lǐng)域具有重要意義。二、基本原理(一 )分子熒光的產(chǎn)生大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子。根據(jù)保里不相容原理，基態(tài)分子的每一個軌道中兩個電子的自旋方向總是相反的，因而大多數(shù)基態(tài)分子處于單重態(tài)(2S+1=1) ，基態(tài)單重態(tài)以S0 表示。當物質(zhì)受光照射時，基態(tài)分子吸收光能就會產(chǎn)生電子能級躍遷而處于第一、第二電子激發(fā)單重態(tài)，以S1、 S2 表示。處于電子激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它會很快地通過

4、無輻射躍遷和輻射躍遷釋放能量而返回基態(tài)。輻射躍遷發(fā)生光子的發(fā)射，產(chǎn)生分子熒光和分子磷光；無輻射躍遷則以熱的形式釋放能量，包括振動弛豫 (VR) 、內(nèi)轉(zhuǎn)化 (ic) 和體系間竄躍 (isc)等。圖 5-1 為分子內(nèi)所發(fā)生的各種光物理過程的示意圖。圖 5-01分子內(nèi)的光物理過程 .doc圖 5-01分子內(nèi)的光物理過程 .JPG圖 5-1 分子內(nèi)的光物理過程 A1,A 2-吸收 F-熒光 P-磷光 ic- 內(nèi)轉(zhuǎn)化isc- 體系間竄躍VR- 振動弛豫振動弛豫是在同一電子能級中，分子由較高振動能級向該電子態(tài)的最低振動能級的非輻射躍遷。振動弛豫過程的速率極大，在 10-1410-12 s 內(nèi)即可完成。內(nèi)轉(zhuǎn)

5、化是相同多重態(tài)的兩個電子態(tài)之間(如 S2S1,S1S0)的非輻射躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)化過程的速率在很大程度上決定于相關(guān)能級之間的能量差。相鄰單重激發(fā)態(tài)之間能級較近，其振動能級常發(fā)生重疊，內(nèi)轉(zhuǎn)化很快。因此，通常不論分子被激發(fā)到哪一個電子激發(fā)態(tài)，在 10-13 10-11s 內(nèi)經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)化和振動弛豫都會躍遷到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級上?；鶓B(tài) (S0)和第一電子激發(fā)單重態(tài) (S1)之間的能量差較大， 因而 S1 S0 內(nèi)轉(zhuǎn)化的速率相對要小得多，使得第一電子激發(fā)態(tài)有相對較長的壽命。處于第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動能級的分子，以輻射躍遷的形式返回基態(tài)各振動能級時，就產(chǎn)生了分子熒光。由于激發(fā)態(tài)中存在有振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化

6、現(xiàn)象。使得熒光的光子能量比其分子受激發(fā)所吸收的光子能量低。因此，熒光波長總比激3發(fā)波長 或 要長。而且，不論電子開始被激發(fā)至哪個能級，12都將只發(fā)射波長為 的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-9 10-6s 內(nèi)完成。3體系間竄躍是指不同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍遷。當分子的第一、二電子處于激發(fā)三重態(tài) (2S+1=3)時，以 Tl、 T2 表示。單重激發(fā)態(tài) Sl 的最低振動能級同三重態(tài) T1 的較高振動能級重疊。因而 S1T1 的體系間竄躍就有了較大的可能性。第一電子激發(fā)單重態(tài)的分子經(jīng)體系間竄躍到達三重態(tài)后，快速振動弛豫至最低振動能級v=0 上。此時有兩種途徑返回基態(tài)，一是輻射躍遷發(fā)出磷光，二是體系間

7、竄躍。由于改變電子自旋的躍遷屬禁阻躍遷，因而躍遷速率小得多，使得三重態(tài)有較長的壽命，約為 10-310 s(二 )熒光效率及其影響因素1熒光效率物質(zhì)在吸收了紫外和可見光后，激發(fā)態(tài)分子是以輻射躍遷還是以非輻射躍遷回到基態(tài)，決定了物質(zhì)是否能發(fā)熒光。通常以熒光效率 (或熒光量子產(chǎn)率 )來描述輻射躍遷概率的大小。熒光效率定義為發(fā)熒光的分子數(shù)目與激發(fā)態(tài)分子總數(shù)的比值，即熒光效率 f發(fā)熒光的分子數(shù) 1)(5激發(fā)態(tài)分子總數(shù)熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā)射的熒光也就越強，若以各種躍遷的速率常數(shù)來表示，則fK f(5 2)K fK i式中： Kf 為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，Ki 為非輻射躍遷的速率常數(shù)

8、之和。一般來說，Kf 主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。而Ki 則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。具有分析應(yīng)用價值的熒光化合物，其熒光效率在0.1 1 之間。2熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系首先，物質(zhì)只有能夠吸收紫外可見光。才有可能發(fā)熒光。因此，發(fā)熒光的物質(zhì)分子中必須含有共軛雙鍵這樣的強吸收基團，且共軛體系越大，電子的離域性越強，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光。大部分能發(fā)熒光的物質(zhì)都含有一個以上的芳環(huán)，隨共軛芳環(huán)增大，熒光效率提高，熒光峰向長波長方向移動。如萘的熒光效率為0.29，熒光波長為310 nm，而蒽的熒光效率為0.46，熒光波長為400 nm。其次，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)有利于熒光的產(chǎn)生。以熒光黃和酚酞為

9、例，二者結(jié)構(gòu)十分相似，但熒光黃在0.1mol ·L-1 NaOH溶液中的熒光效率高達0.92。而酚酞由于沒有氧橋，分子不易保持剛性平面，不易產(chǎn)生熒光。剛性平面結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動相碰撞去活的可能性。一些有機配位劑與金屬離子形成螯合物后熒光大大增強，這也可用剛性結(jié)構(gòu)的影響來解釋。 例如， 8羥基喹啉本身熒光較弱，與 Mg 2+ 形成螯合物后則是強熒光化合物。再如，滂鉻 BBR 本身不發(fā)熒光，與 Al 3+ 在 pH4.5 時形成的螯合物發(fā)紅色熒光。Al3+- 滂鉻 BBR 螯合物 .JPG取代基對熒光物質(zhì)的熒光特征和強度也有很大影響。給電子取代基如 OH 、 NH 2、 NR 2 和

10、 OR 等可使共軛體系增大，導(dǎo)致熒光增強；吸電子取代基如 COOH 、 NO 和 NO 2 等使熒光減弱，例如，苯胺和苯酚的熒光較苯強，而硝基苯為非熒光物質(zhì)。隨著鹵素取代基中鹵素原子序數(shù)的增加，物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強。這種所謂的“重原子效應(yīng)”是由于重原子中能級交叉現(xiàn)象嚴重，容易發(fā)生自旋軌道偶合作用，使S1T1 的體系間竄躍顯著增加所致。3環(huán)境因素對熒光的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。一般來說，電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性。溶劑的極性增強，對激發(fā)態(tài)會產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強度增大。例如，奎寧在苯、乙醇和水中熒光效率的相對大小為1、30

11、和 1000。溫度對于溶液熒光強度的影響非常顯著。通常認為，輻射躍遷的速率基本不隨溫度而變，而非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著地增大。因此，對于大多數(shù)熒光物質(zhì)，升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。由于三重態(tài)的壽命比單重激發(fā)態(tài)壽命更長，溫度對于磷光影響比熒光更大。大多數(shù)含有酸性或堿性取代基團的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液 pH 的影響很大。共軛酸堿兩種型體具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，各具有自己特殊的熒光效率 和熒光波長，例如 ：不同共軛體系的熒光.JPG不同共軛體系的熒光.doc溶液中表面活性劑的存在，可以使熒光物質(zhì)處于更有序的膠束微環(huán)境中， 對處于激發(fā)單

12、重態(tài)的熒光物質(zhì)分子起保護作用，減小非輻射躍遷的概率，提高熒光效率。由于氧分子的順磁性質(zhì)，溶液中溶解氧的存在，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速率加大，因而會使熒光效率降低。其它順磁性物質(zhì)也有這種作用。(三 )熒光強度與溶液濃度的關(guān)系根據(jù)熒光效率的定義，熒光強度I f 應(yīng)為所吸收的輻射強度Ia 與熒光效率 f的乘積：If = fIa =f(I0-I)由于AI 0-AlgI=I0·10I可得If=fI0(1-10-A)23I ff- 2.3A2.3A(53)I0 2.3A-3!2!如果溶液很稀，吸光度A<0.05，方括號中其它各項與第一項相比均可忽略不計，則上式可簡化為If=

13、2.3fI0A= 2.3fI 0kbc(54)可見，當 A<0.05 時，熒光強度與物質(zhì)的熒光效率、激發(fā)光強度、物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)和溶液的濃度成正比。對于一給定物質(zhì)，當激發(fā)光波長和強度一定時，熒光強度只與溶液濃度有關(guān)：If=Kc(55)上式為熒光定量分析的基本依據(jù)。以熒光強度對熒光物質(zhì)的濃度作圖，在低濃度時，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當熒光物質(zhì)的溶液濃度較高時，熒光強度同濃度之間的線性關(guān)系將發(fā)生偏離，有時甚至隨溶液濃度增大而降低(圖 5-02 熒光強度與溶液濃度的關(guān)系 .JPG圖 5-2)。導(dǎo)致標準曲線彎曲的原因，除了式 (5-3) 中的高次項影響外，還存在猝滅效應(yīng)。熒光猝滅是指熒光物質(zhì)分子與

14、溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強度下降的物理或化學(xué)作用過程。與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強度下降的物質(zhì)、稱為熒光猝滅劑。前面提到的氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑。由熒光物質(zhì)自身引起的熒光強度減弱的現(xiàn)象稱為熒光自猝滅效應(yīng)。經(jīng)常遇到的自猝滅現(xiàn)象有兩種。一種是當熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光通過溶液時被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。另一種是由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞，導(dǎo)致非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。很顯然，不論哪種情況，增大熒光物質(zhì)的濃度均會使熒光猝滅效應(yīng)增強，從而導(dǎo)致標準曲線向濃度軸彎曲，即使熒光強度降低。(四 )熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以不同波長的

15、入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，并在熒光最強的波長處測量熒光強度，以激發(fā)波長為橫坐標。熒光強度為縱坐標繪制關(guān)系曲線，便得到熒光激發(fā)光譜。激發(fā)光譜實質(zhì)上就是熒光物質(zhì)的吸收光譜。若固定激發(fā)光的波長和強度不變，測量不同波長下的熒光強度，繪制熒光強度隨波長變化的關(guān)系曲線，使得到熒光發(fā)射光譜，簡稱熒光光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光測定時選擇激發(fā)波長和熒光測量波長的依據(jù)，也可用于鑒別熒光物質(zhì)。三、熒光分析儀器常用的熒光分析儀器也是由光源、單色器、液槽、檢測器和信號顯示記錄器五部分組成。它與分光光度計比較主要差別有兩點。第一，熒光分析儀器采用垂直測量方式，即在與激發(fā)光相垂直的方向測量熒光(圖 5-03 熒光分析儀器示意

16、圖.doc圖 5-03 熒光分析儀器示意圖 .JPG如圖 5-3 所示 )，以消除透射光的影響。第二，熒光分析儀器有兩個單色器，一個是激發(fā)單色器，置于液槽前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個是發(fā)射單色器，置于液槽和檢測器之間， 用于分出某一波長的熒光， 消除其它雜散光干擾。(一)光源熒光測量中的激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度。在熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源；在熒光分光光度計中，通常采用高壓汞燈或氙弧燈作光源。高壓汞燈是利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源，其光譜略呈帶狀，以365nm 的譜線為最強。熒光分析中常使用365nm、405nm 和 436nm 三條譜線。高壓氙弧燈是熒光分光

17、光度計中應(yīng)用雖廣泛的一種光源。氙燈是一種短弧氣體放電燈，工作時，在相距約 8mm 的鎢電極間形成一強電子流(電弧 )，氙原子與電子流相撞而解離為正離子，氙正離子與電子復(fù)合而發(fā)光，其光譜在250800 nm 范圍內(nèi)呈連續(xù)光譜。此外，作為一種新型熒光激發(fā)光譜，可調(diào)諧染料激發(fā)器顯示出了巨大的優(yōu)勢。(二)單色器熒光計的單色器是濾光片，因而熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜。熒光分光光度汁一般采用兩個光柵單色器。熒光分光光度計既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。(三)檢測器熒光的強度一般較弱，要求檢測器具有較高的靈敏度。熒光計采用光電管作檢測器，熒光分光光度計采用光電倍增管作為檢測器。熒光分析之所以具

18、有比吸收光度法高得多的靈敏度，是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測十分微弱光信號的能力，而且熒光強度與激發(fā)光強度成正比， 提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定靈敏度提高。吸收光度法則不然，它測定的是吸光度，不管是增大入射光強度I0，還是提高檢測器的靈敏度，都會使透過光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值并不會改變，因而靈敏度不能提高。四、熒光分析法的應(yīng)用(一)無機化合物的分析大多數(shù)無機離子與溶劑之間的相互作用很強，其激發(fā)態(tài)多以非輻射躍遷方式返回基態(tài)，發(fā)熒光者甚少。然而很多無機離子可以與一些有機化合物形成有熒光的絡(luò)合物，利用這一性質(zhì)可對其進行熒光測定。目前采用有機試劑進行熒光分析的元素已近 70

19、 種，其中較常采用熒光法測定的元素有鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素等。能夠同金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物。它們通常含有兩個或兩個以上的官能團，能與金屬離子形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物。由于螯合物的生成，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，使原來不發(fā)熒光或熒光較弱的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)閺姛晒饣衔?。例如，熒光鎵在pH5.0 時與 Al 3+形成發(fā)射黃綠色熒光的絡(luò)合物,pH3.0 時與 Ga3+形成發(fā)射黃色熒光的絡(luò)合物；安息香在堿性介質(zhì)中與硼酸鹽形成發(fā)射綠藍色熒光的絡(luò)合物，與 Zn2+形成發(fā)射綠色熒光的絡(luò)合物；桑色素在堿性溶液中與 Be2+形成發(fā)射黃綠色熒光的絡(luò)合物等。熒光分析中

20、常用的另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。例如，羅丹明 B 為陽離子熒光染料，Au3+、Ga3+ 、Tl 3+等陽離子首先與Cl-、Br-等鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹明 B 締合形成熒光化合物。 再如，曙紅為陰離子熒光染料，Ag +與鄰菲咯啉形成的二元絡(luò)陽離子，再與曙紅締合后可使其熒光猝滅，由熒光降低的程度也可對Ag+ 進行分析。熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。除了上述Ag +外，可采用熒光猝滅法間接測定的離子還有F-、S2-、 Fe3+、Co2+ 、Ni 2+、 Cu2+等。(二)有機化合物約分析脂肪族有機化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，本身能發(fā)生熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能

21、進行熒光分析。如丙三醇與苯胺在濃硫酸介質(zhì)中反應(yīng)生成發(fā)射藍色熒光的喹啉，據(jù)此可以測定 0.1 的丙三醇。芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可以直接用熒光法測定。如在微堿性條件下，可測定0.001g·mL -1 以上的對氨基萘碘酸及05g·mL -1 的蒽。對于具有致癌活性的多環(huán)芳烴。 熒光分析法已成為員主要的測定方法。為了提高測定的靈敏度，有時也將芳香族化合物與適當試劑反應(yīng)之后再進行測定。例如，水楊酸與鋱形成絡(luò)合物后。熒光增強，測定靈敏度提高。再如，糖尿病研究中的重要物質(zhì)阿脲(四氧嘧啶 )與苯二胺反應(yīng)后，熒光增強，可用于測定血液中低至10-10 mol 阿脲

22、 。在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析領(lǐng)域，許多重要的分析對象，如維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類和甾族化物、酶和輔酶等，均可用熒光法分析。由于熒光法的高靈敏度，它還用于生理過程中生物活性物質(zhì)之間的相互作用、生化物質(zhì)的變化以及反應(yīng)動力學(xué)過程的研究和監(jiān)視。第二節(jié)磷光分析法一、概述磷光是分子從亞穩(wěn)的三重態(tài)躍遷至基態(tài)時所產(chǎn)生的輻射。磷光分析法是以分子磷光光譜來鑒別有機化合和進行定量分析的一種方法。 但是在 1975 年以前。絕大多數(shù)磷光分析工作都是在低溫條件下進行的， 后來相繼出現(xiàn)了一些室溫磷光分析方法，如固體表面室溫磷光法、膠束增穩(wěn)室溫磷法和敏化室溫磷光法等分析方法，使磷光分析法在藥物分析、

23、臨床分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益發(fā)展，并與熒光分析相互補充，在有機定量分折中發(fā)揮出愈來愈重要的作用。二、基本原理(一)產(chǎn)生和磷光強度前已述及，磷光是由處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時所產(chǎn)生的輻射。 由于分子的第一電子激發(fā)三重態(tài)(T1)的能量低于其第一電子激發(fā)單重態(tài)，因此，磷光輻射的波長比熒光更長。三重態(tài) T1 向基態(tài) 0 屬自禁阻躍遷。躍遷速率小，使得三重態(tài)穩(wěn)定性大， 因而磷光比熒光有長很多的壽命。當激發(fā)光停止后，熒光立即消失，而磷則將持續(xù)一段時間(10-4 10s)三重態(tài)的壽命較長，使得激發(fā)態(tài)分子發(fā)生T1S0 體系間竄躍這種非輻射躍遷的概率較大。因而，磷光物質(zhì)在室溫溶液中產(chǎn)生的磷光一般都比較弱。當

24、磷光物質(zhì)濃度很小時，磷光強度Ip 與磷光物質(zhì)濃度c 之間的關(guān)系為Ip=2.3pI0kbc(56)式中： 為磷光效率， pI0為激發(fā)光的強度，k 為磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b 為試樣池的光程。在一定的條件下，、I 、ppk、b 均為常數(shù)，因此式(56)可寫成Ip=Kc根據(jù)上式可以用磷光強度對磷光物質(zhì)濃度制作定量分析的標準曲線(二)溫度對磷光強度的影響溶液中物質(zhì)的磷光強度與溫度有密切的關(guān)系。在室溫條件下，溶劑分子熱運動比較劇烈，絕大多數(shù)處于激發(fā)三重態(tài)的物質(zhì)分子均會與溶劑分子碰撞而失活，磷光很難產(chǎn)生。隨著溫度的降低，分子熱運動速率減慢，磷光逐漸增強。當溶液在液氮中冷凍至玻璃狀時，某些物質(zhì)可以產(chǎn)生很強

25、的磷光。低溫磷光分析就是基于這一原理而建立起來的。對于吲哚、色氨酸和利血平等物質(zhì)，其低溫磷光分析法有比熒光法更高的靈敏度。(三)重原子效應(yīng)使用含有重原子的溶劑(如碘乙烷、溴乙烷 )或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質(zhì)的磷光強度，這種效應(yīng)稱作重原子效應(yīng)。前者稱為外部重原子效應(yīng)，后者稱為內(nèi)部重原子效應(yīng)。重原子效應(yīng)的機理是，重原子的高核電荷使得磷光分子的電子能級交錯，容易引起或增強磷光分子的自旋軌道偶合作用。從而使S1T1 的體系間竄躍概率增大。有利于增大磷光效率。利用重原子效應(yīng)是提高磷光分析靈敏度的簡單而有效的手段。 目前應(yīng)用較多的除重原子溶劑外，還可采用碘化物，Ag +鹽、 Pb2

26、+鹽和 Ti +鹽也有應(yīng)用。(四)室溫磷光在一般情況下，溶液中磷光物質(zhì)的室溫磷光太弱。不能用于分析。當向溶液中加入適當?shù)谋砻婊钚詣r，由于形成了表面活性劑膠束， 改變了磷光物質(zhì)的微環(huán)境，增強了定向約束力，從而減少了磷光分子與溶劑分子的碰撞概率。增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致磷光強度顯著增大，稱此為膠束增穩(wěn)室溫磷光。當磷光物質(zhì)吸附于某些固體表面時，分子的剛性增加，三重態(tài)的碰撞去活化概率大大減小，也可在室溫下產(chǎn)生較強的磷光。由此又產(chǎn)生了固體表面室溫磷光分析方法。三、磷光分析儀器磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，也是由光源、激發(fā)單色器、液槽、發(fā)射單色器、檢測器和放大顯示裝置所組成。由于分析原理上的差別，磷

27、光分析儀器有些特殊部件。1試樣室測定低溫磷光一般在液氮溫度(77K) 下進行，盛放試液的試樣池需放置在盛液氮的杜瓦瓶內(nèi)。固體表面室溫磷光分析則需特制的試樣室。2磷光鏡有些物質(zhì)既產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。為了在有熒光現(xiàn)象的體系中測定磷光，常采用一種叫磷光鏡的機械切光裝置，利用熒光與磷光壽命的差異消除熒光干擾?，F(xiàn)代的磷光分析儀多采用脈沖光源與程控檢測相結(jié)合的時間分辨技術(shù)。四、磷光分析法的應(yīng)用磷光分析法在藥物分析、臨床分析及環(huán)境分析領(lǐng)域得到了一定的應(yīng)用。它與熒光法互相補充，已成為痕量有機物分析的重要手段。低溫磷光分析已應(yīng)用于萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴以及含氮、硫和氧的雜環(huán)化合物分析，還用于阿司匹

28、林、柯卡因、磺胺密啶、維生策K 、B6、E 等許多藥物的分析。固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物快速靈敏的分析手段。膠束增穩(wěn)室溫磷光分析已用于萘、芘、聯(lián)苯的分析。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光分析法一、概述化學(xué)發(fā)光分析是利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。在化學(xué)發(fā)光中，發(fā)光物質(zhì)所需的激發(fā)能既不是光。也不是熱和電，而是由化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能?；瘜W(xué)發(fā)光現(xiàn)象自 19 世紀中期就為人們所熟知， 但應(yīng)用于分析化學(xué)卻是 20 世紀五六十年代的事。 1970 年左右?；瘜W(xué)發(fā)光法被推薦作為監(jiān)測空氣污染物的方法。 70 年代后，液相化學(xué)發(fā)光分析得到快速發(fā)展。目前，這一方法已廣泛地應(yīng)用于

29、痕量元素分析、環(huán)境監(jiān)測以及生物醫(yī)學(xué)分析等領(lǐng)域，成為一種重要的痕量分析手段?；瘜W(xué)發(fā)光分析具有下列突出特點：(1)靈敏度很高。 例如，用熒光素酶和腺苷三磷酸 (ATP)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測定低至 2×10-17mol/L ATP;利用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測定 Cr3+,Co2+等離子的檢出限也低至 10-12g/mL 。(2)測定的線性范圍寬。一般有56 個數(shù)量級。(3)儀器設(shè)備簡單?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀沒有激發(fā)光源，由于不存在雜散光和散射光等引起的背景干擾，并且檢測的是整個光譜范圍內(nèi)的發(fā)光總量，因而也不需要單色器。(4)分析速度快。流動注射化學(xué)發(fā)光分析每小時可測定100個以上的試樣。二、基本原

30、理(一)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件化學(xué)發(fā)光的激發(fā)能由化學(xué)反應(yīng)所提供，在反應(yīng)過程中，某一反應(yīng)產(chǎn)物的分子接受反應(yīng)能被激發(fā)，形成電子激發(fā)態(tài)，當它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時以輻射的形式將能量釋出來。這一過程可表示為A+B C?+DC?C+?能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)必須具備下述條件：(1)能快速地釋放出足夠的能量。根據(jù)E ?計算，在可見光區(qū)觀察到化學(xué)發(fā)光，需 170300 kJ ·mol-1 激發(fā)能。一些氧化還原反應(yīng)，特別是具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化反應(yīng)可滿足這種要求，(2)反應(yīng)途徑有利于激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的形成。(3)激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，或能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移給可以產(chǎn)生輻射躍遷的其它分子。(二)化學(xué)

31、發(fā)光效率和發(fā)光強度化學(xué)發(fā)光效率 定義為CL發(fā)射的分子數(shù)cl參加反應(yīng)的分子數(shù)rf(5-8)它等于生成激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率r和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率 f之乘積。激發(fā)態(tài)分子發(fā)射的光子數(shù)r參加反應(yīng)的分子數(shù)f激發(fā)態(tài)分子數(shù)化學(xué)效率 r主要取決于發(fā)光所依賴的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率 f的影響因素與熒光效率的影響因素相同。既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，亦受環(huán)境的影響。具有最高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體系中的化學(xué)發(fā)光，亦稱生物發(fā)光 (Bioluminescence)。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率很少超過0.01。被人們認為是最有效的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的魯米諾反應(yīng)，發(fā)光效率也僅為0.010.5?；瘜W(xué)發(fā)光強度 ICL 與反應(yīng)速率關(guān)

32、 dc 有如dt下關(guān)系：I CL (t )CLdc(5-9)dt由于化學(xué)發(fā)光的強度隨著時間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小，如果反應(yīng)是一級動力學(xué)反應(yīng)，t 時刻的ICL (t)與該時刻分析物濃度 c 成正比，即化學(xué)發(fā)光峰值強度與分析物濃度成線性關(guān)系。在化學(xué)發(fā)光分析中，常用發(fā)光總強度來進行定量分析。為此，將式 (59)積分，得I CL dtdcCLdtdtCLc(5 10)由式 (5-10)得只，發(fā)光總強度與分析物濃度成正比，因此，根據(jù)已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度來進行化學(xué)分析的定量分析.(三)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1. 液相化學(xué)發(fā)光 魯米諾在堿性溶液中被 H2O2、I2 等氧化劑氧化，可產(chǎn)生最大波長為425nm

33、 波長的光輻射。魯米諾在堿性溶液中化學(xué)發(fā)光.doc魯米諾在堿性溶液中化學(xué)發(fā)光.JPG除魯米諾外，光澤精、沒食子酸和洛粉堿等也可被氧化劑氧化產(chǎn)生液相化學(xué)發(fā)光。2氣相化學(xué)發(fā)光在氣相中， O3 能氧化 NO、乙烯等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，原子氧也能氧化SO2、 NO、CO 等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。例如：NO+O3 NO?+O2? NO2+ ?v2NO2( 600nm)CO+O CO2?CO2? CO2+ ?v( =300500nm)三、化學(xué)發(fā)光分析的儀器(一)分立取樣式儀器分立式化學(xué)發(fā)光分析儀是一種靜態(tài)下測量液相化學(xué)發(fā)光信號的裝置。 基本構(gòu)造如圖54 所示。先將試劑與試樣加入貯液管中，然后開啟旋塞使溶液流入反應(yīng)池混合

34、，混合后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)立即發(fā)生。發(fā)光信號通過光倍增電管檢測，再經(jīng)放大后在記錄儀上記錄下來。分立式儀器具有簡單、靈敏度高的待點，還可用于反應(yīng)動力學(xué)的研究。但手工進樣重復(fù)性差，測量的精密度不高，且難于實現(xiàn)自動化，分析效率也比較低。圖 5-04 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖.JPG圖 5-04 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .doc圖 5-4 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖1- 反應(yīng)器 2- 反應(yīng)池 3- 恒溫水箱 4- 貯液管 5- 濾光片 6-光自倍增管圖 5-5 流動注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖R試劑載流S 一試液P 一蠕動泵V 進樣閥D 一化學(xué)發(fā)光檢測器(二)流動注射式儀器流動注射分析是一種自動化溶

35、液分析技術(shù)。它是把一定體積的試液 (幾十至幾百微升 )注射到一個連續(xù)流動著的載流中，試樣在流動過程中分散、反應(yīng)，并被檢測。流動注射式化學(xué)發(fā)光分析儀如圖 5 5 所示。由蠕動泵、進樣閥、反應(yīng)盤管和化學(xué)發(fā)光檢測器組成。蠕動泵的作用在于推動載流在一細孔徑管道中連續(xù)穩(wěn)定地流動。進樣閥以重現(xiàn)性很高的方式把一定體積的試液注射到載流中，在流動過程中，試液逐漸分散并與載流中的試劑發(fā)生反應(yīng)。在化學(xué)發(fā)光檢測器中，化學(xué)發(fā)光信號被光電倍增管檢測，經(jīng)放大后記錄下來。圖 5-05 流動注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .doc圖 5-05 流動注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .JPG由于流動注射式儀器被檢測的光信號只是整個發(fā)光動力學(xué)曲線的一部分，必須根據(jù)反應(yīng)速率調(diào)整進樣閥至檢測器之間的管道長度或流速，以控制留存時間，使發(fā)光信號的峰值恰好被檢測，從而獲得最大靈敏度。四、化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用氣相化學(xué)發(fā)光已廣泛地應(yīng)用于大氣中 O3、NO、NO2 H2