分子發(fā)光分析法

1、第五章分子發(fā)光分析法基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)光 (Molecular Luminescence)。依據(jù)激發(fā)的模式不同，分子發(fā)光分為光致發(fā)光、熱致發(fā)光、場(chǎng)致發(fā)光和化學(xué)發(fā)光等。光致發(fā)光按激發(fā)態(tài)的類(lèi)型又可分為熒光和磷光兩種。本章討論分子熒光(Molecular Fluorescence)、分子磷光 (Molecular Phosphorescence)和化學(xué)發(fā)光 (Chemiluminescence)分析法。第一節(jié)熒光分析法一、概述分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。早在 16

2、 世紀(jì)，人們觀察到當(dāng)紫外和可見(jiàn)光照射到某些物質(zhì)時(shí)。這些物質(zhì)就會(huì)發(fā)出各種顏色和不同強(qiáng)度的光，而當(dāng)照射停止時(shí)，物質(zhì)的發(fā)光也隨之很快消失。到 1852 年才由斯托克斯(Stokes)給予了解釋?zhuān)此俏镔|(zhì)在吸收了光能后發(fā)射出的分子熒光。斯托克斯在對(duì)熒光強(qiáng)度與濃度之間的關(guān)系進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，于1864 年提出可將熒光作為一種分析手段。1867 年Goppelsroder 應(yīng)用鋁桑色素絡(luò)合物的熒光對(duì)鋁進(jìn)行了測(cè)定。進(jìn)入 20 世紀(jì)，隨著熒光分析儀器的問(wèn)世， 熒光分析的方法和技術(shù)得到了極大發(fā)展， 如今已成為一種重要且有效的光譜分析手段。熒光分析法的最大優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，它的檢出限通常比分光光度法低 24 個(gè)數(shù)

3、量級(jí)，選擇性也較分光光度法好。雖然能產(chǎn)生強(qiáng)熒光的化合物相對(duì)較少，熒光分析法的應(yīng)用不如分光光度法廣泛，但由于它的高靈敏度以及許多重要的生物物質(zhì)都具有熒光性質(zhì)。使得該方法在藥物、臨床、環(huán)境、食品的微量、痕量分析以及生命科學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域具有重要意義。二、基本原理(一 )分子熒光的產(chǎn)生大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子。根據(jù)保里不相容原理，基態(tài)分子的每一個(gè)軌道中兩個(gè)電子的自旋方向總是相反的，因而大多數(shù)基態(tài)分子處于單重態(tài)(2S+1=1) ，基態(tài)單重態(tài)以S0 表示。當(dāng)物質(zhì)受光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能就會(huì)產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷而處于第一、第二電子激發(fā)單重態(tài)，以S1、 S2 表示。處于電子激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它會(huì)很快地通過(guò)

4、無(wú)輻射躍遷和輻射躍遷釋放能量而返回基態(tài)。輻射躍遷發(fā)生光子的發(fā)射，產(chǎn)生分子熒光和分子磷光；無(wú)輻射躍遷則以熱的形式釋放能量，包括振動(dòng)弛豫 (VR) 、內(nèi)轉(zhuǎn)化 (ic) 和體系間竄躍 (isc)等。圖 5-1 為分子內(nèi)所發(fā)生的各種光物理過(guò)程的示意圖。圖 5-01分子內(nèi)的光物理過(guò)程 .doc圖 5-01分子內(nèi)的光物理過(guò)程 .JPG圖 5-1 分子內(nèi)的光物理過(guò)程 A1,A 2-吸收 F-熒光 P-磷光 ic- 內(nèi)轉(zhuǎn)化isc- 體系間竄躍VR- 振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫是在同一電子能級(jí)中，分子由較高振動(dòng)能級(jí)向該電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的非輻射躍遷。振動(dòng)弛豫過(guò)程的速率極大，在 10-1410-12 s 內(nèi)即可完成。內(nèi)轉(zhuǎn)

5、化是相同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)之間(如 S2S1,S1S0)的非輻射躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)化過(guò)程的速率在很大程度上決定于相關(guān)能級(jí)之間的能量差。相鄰單重激發(fā)態(tài)之間能級(jí)較近，其振動(dòng)能級(jí)常發(fā)生重疊，內(nèi)轉(zhuǎn)化很快。因此，通常不論分子被激發(fā)到哪一個(gè)電子激發(fā)態(tài)，在 10-13 10-11s 內(nèi)經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)化和振動(dòng)弛豫都會(huì)躍遷到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上?；鶓B(tài) (S0)和第一電子激發(fā)單重態(tài) (S1)之間的能量差較大， 因而 S1 S0 內(nèi)轉(zhuǎn)化的速率相對(duì)要小得多，使得第一電子激發(fā)態(tài)有相對(duì)較長(zhǎng)的壽命。處于第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子，以輻射躍遷的形式返回基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)，就產(chǎn)生了分子熒光。由于激發(fā)態(tài)中存在有振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化

6、現(xiàn)象。使得熒光的光子能量比其分子受激發(fā)所吸收的光子能量低。因此，熒光波長(zhǎng)總比激3發(fā)波長(zhǎng) 或 要長(zhǎng)。而且，不論電子開(kāi)始被激發(fā)至哪個(gè)能級(jí)，12都將只發(fā)射波長(zhǎng)為 的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-9 10-6s 內(nèi)完成。3體系間竄躍是指不同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)間的非輻射躍遷。當(dāng)分子的第一、二電子處于激發(fā)三重態(tài) (2S+1=3)時(shí)，以 Tl、 T2 表示。單重激發(fā)態(tài) Sl 的最低振動(dòng)能級(jí)同三重態(tài) T1 的較高振動(dòng)能級(jí)重疊。因而 S1T1 的體系間竄躍就有了較大的可能性。第一電子激發(fā)單重態(tài)的分子經(jīng)體系間竄躍到達(dá)三重態(tài)后，快速振動(dòng)弛豫至最低振動(dòng)能級(jí)v=0 上。此時(shí)有兩種途徑返回基態(tài)，一是輻射躍遷發(fā)出磷光，二是體系間

7、竄躍。由于改變電子自旋的躍遷屬禁阻躍遷，因而躍遷速率小得多，使得三重態(tài)有較長(zhǎng)的壽命，約為 10-310 s(二 )熒光效率及其影響因素1熒光效率物質(zhì)在吸收了紫外和可見(jiàn)光后，激發(fā)態(tài)分子是以輻射躍遷還是以非輻射躍遷回到基態(tài)，決定了物質(zhì)是否能發(fā)熒光。通常以熒光效率 (或熒光量子產(chǎn)率 )來(lái)描述輻射躍遷概率的大小。熒光效率定義為發(fā)熒光的分子數(shù)目與激發(fā)態(tài)分子總數(shù)的比值，即熒光效率 f發(fā)熒光的分子數(shù) 1)(5激發(fā)態(tài)分子總數(shù)熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā)射的熒光也就越強(qiáng)，若以各種躍遷的速率常數(shù)來(lái)表示，則fK f(5 2)K fK i式中： Kf 為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，Ki 為非輻射躍遷的速率常數(shù)

8、之和。一般來(lái)說(shuō)，Kf 主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。而Ki 則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。具有分析應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物，其熒光效率在0.1 1 之間。2熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系首先，物質(zhì)只有能夠吸收紫外可見(jiàn)光。才有可能發(fā)熒光。因此，發(fā)熒光的物質(zhì)分子中必須含有共軛雙鍵這樣的強(qiáng)吸收基團(tuán)，且共軛體系越大，電子的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光。大部分能發(fā)熒光的物質(zhì)都含有一個(gè)以上的芳環(huán)，隨共軛芳環(huán)增大，熒光效率提高，熒光峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。如萘的熒光效率為0.29，熒光波長(zhǎng)為310 nm，而蒽的熒光效率為0.46，熒光波長(zhǎng)為400 nm。其次，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)有利于熒光的產(chǎn)生。以熒光黃和酚酞為

9、例，二者結(jié)構(gòu)十分相似，但熒光黃在0.1mol ·L-1 NaOH溶液中的熒光效率高達(dá)0.92。而酚酞由于沒(méi)有氧橋，分子不易保持剛性平面，不易產(chǎn)生熒光。剛性平面結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)相碰撞去活的可能性。一些有機(jī)配位劑與金屬離子形成螯合物后熒光大大增強(qiáng)，這也可用剛性結(jié)構(gòu)的影響來(lái)解釋。 例如， 8羥基喹啉本身熒光較弱，與 Mg 2+ 形成螯合物后則是強(qiáng)熒光化合物。再如，滂鉻 BBR 本身不發(fā)熒光，與 Al 3+ 在 pH4.5 時(shí)形成的螯合物發(fā)紅色熒光。Al3+- 滂鉻 BBR 螯合物 .JPG取代基對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。給電子取代基如 OH 、 NH 2、 NR 2 和

10、 OR 等可使共軛體系增大，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)；吸電子取代基如 COOH 、 NO 和 NO 2 等使熒光減弱，例如，苯胺和苯酚的熒光較苯強(qiáng)，而硝基苯為非熒光物質(zhì)。隨著鹵素取代基中鹵素原子序數(shù)的增加，物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。這種所謂的“重原子效應(yīng)”是由于重原子中能級(jí)交叉現(xiàn)象嚴(yán)重，容易發(fā)生自旋軌道偶合作用，使S1T1 的體系間竄躍顯著增加所致。3環(huán)境因素對(duì)熒光的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性。溶劑的極性增強(qiáng)，對(duì)激發(fā)態(tài)會(huì)產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度增大。例如，奎寧在苯、乙醇和水中熒光效率的相對(duì)大小為1、30

11、和 1000。溫度對(duì)于溶液熒光強(qiáng)度的影響非常顯著。通常認(rèn)為，輻射躍遷的速率基本不隨溫度而變，而非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著地增大。因此，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，升高溫度會(huì)使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。由于三重態(tài)的壽命比單重激發(fā)態(tài)壽命更長(zhǎng)，溫度對(duì)于磷光影響比熒光更大。大多數(shù)含有酸性或堿性取代基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液 pH 的影響很大。共軛酸堿兩種型體具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，各具有自己特殊的熒光效率 和熒光波長(zhǎng)，例如 ：不同共軛體系的熒光.JPG不同共軛體系的熒光.doc溶液中表面活性劑的存在，可以使熒光物質(zhì)處于更有序的膠束微環(huán)境中， 對(duì)處于激發(fā)單

12、重態(tài)的熒光物質(zhì)分子起保護(hù)作用，減小非輻射躍遷的概率，提高熒光效率。由于氧分子的順磁性質(zhì)，溶液中溶解氧的存在，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速率加大，因而會(huì)使熒光效率降低。其它順磁性物質(zhì)也有這種作用。(三 )熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系根據(jù)熒光效率的定義，熒光強(qiáng)度I f 應(yīng)為所吸收的輻射強(qiáng)度Ia 與熒光效率 f的乘積：If = fIa =f(I0-I)由于AI 0-AlgI=I0·10I可得If=fI0(1-10-A)23I ff- 2.3A2.3A(53)I0 2.3A-3!2!如果溶液很稀，吸光度A<0.05，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比均可忽略不計(jì)，則上式可簡(jiǎn)化為If=

13、2.3fI0A= 2.3fI 0kbc(54)可見(jiàn)，當(dāng) A<0.05 時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的熒光效率、激發(fā)光強(qiáng)度、物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)和溶液的濃度成正比。對(duì)于一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，熒光強(qiáng)度只與溶液濃度有關(guān)：If=Kc(55)上式為熒光定量分析的基本依據(jù)。以熒光強(qiáng)度對(duì)熒光物質(zhì)的濃度作圖，在低濃度時(shí)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當(dāng)熒光物質(zhì)的溶液濃度較高時(shí)，熒光強(qiáng)度同濃度之間的線性關(guān)系將發(fā)生偏離，有時(shí)甚至隨溶液濃度增大而降低(圖 5-02 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 .JPG圖 5-2)。導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲的原因，除了式 (5-3) 中的高次項(xiàng)影響外，還存在猝滅效應(yīng)。熒光猝滅是指熒光物質(zhì)分子與

14、溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過(guò)程。與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)、稱為熒光猝滅劑。前面提到的氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見(jiàn)的熒光猝滅劑。由熒光物質(zhì)自身引起的熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象稱為熒光自猝滅效應(yīng)。經(jīng)常遇到的自猝滅現(xiàn)象有兩種。一種是當(dāng)熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光通過(guò)溶液時(shí)被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。另一種是由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞，導(dǎo)致非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。很顯然，不論哪種情況，增大熒光物質(zhì)的濃度均會(huì)使熒光猝滅效應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線向濃度軸彎曲，即使熒光強(qiáng)度降低。(四 )熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以不同波長(zhǎng)的

15、入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，并在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度，以激發(fā)波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)。熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制關(guān)系曲線，便得到熒光激發(fā)光譜。激發(fā)光譜實(shí)質(zhì)上就是熒光物質(zhì)的吸收光譜。若固定激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度不變，測(cè)量不同波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化的關(guān)系曲線，使得到熒光發(fā)射光譜，簡(jiǎn)稱熒光光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光測(cè)定時(shí)選擇激發(fā)波長(zhǎng)和熒光測(cè)量波長(zhǎng)的依據(jù)，也可用于鑒別熒光物質(zhì)。三、熒光分析儀器常用的熒光分析儀器也是由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和信號(hào)顯示記錄器五部分組成。它與分光光度計(jì)比較主要差別有兩點(diǎn)。第一，熒光分析儀器采用垂直測(cè)量方式，即在與激發(fā)光相垂直的方向測(cè)量熒光(圖 5-03 熒光分析儀器示意

16、圖.doc圖 5-03 熒光分析儀器示意圖 .JPG如圖 5-3 所示 )，以消除透射光的影響。第二，熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，一個(gè)是激發(fā)單色器，置于液槽前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個(gè)是發(fā)射單色器，置于液槽和檢測(cè)器之間， 用于分出某一波長(zhǎng)的熒光， 消除其它雜散光干擾。(一)光源熒光測(cè)量中的激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度。在熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源；在熒光分光光度計(jì)中，通常采用高壓汞燈或氙弧燈作光源。高壓汞燈是利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源，其光譜略呈帶狀，以365nm 的譜線為最強(qiáng)。熒光分析中常使用365nm、405nm 和 436nm 三條譜線。高壓氙弧燈是熒光分光

17、光度計(jì)中應(yīng)用雖廣泛的一種光源。氙燈是一種短弧氣體放電燈，工作時(shí)，在相距約 8mm 的鎢電極間形成一強(qiáng)電子流(電弧 )，氙原子與電子流相撞而解離為正離子，氙正離子與電子復(fù)合而發(fā)光，其光譜在250800 nm 范圍內(nèi)呈連續(xù)光譜。此外，作為一種新型熒光激發(fā)光譜，可調(diào)諧染料激發(fā)器顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)。(二)單色器熒光計(jì)的單色器是濾光片，因而熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜。熒光分光光度汁一般采用兩個(gè)光柵單色器。熒光分光光度計(jì)既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。(三)檢測(cè)器熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器具有較高的靈敏度。熒光計(jì)采用光電管作檢測(cè)器，熒光分光光度計(jì)采用光電倍增管作為檢測(cè)器。熒光分析之所以具

18、有比吸收光度法高得多的靈敏度，是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測(cè)十分微弱光信號(hào)的能力，而且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比， 提高激發(fā)光強(qiáng)度也可以增大熒光強(qiáng)度，使測(cè)定靈敏度提高。吸收光度法則不然，它測(cè)定的是吸光度，不管是增大入射光強(qiáng)度I0，還是提高檢測(cè)器的靈敏度，都會(huì)使透過(guò)光信號(hào)與入射光信號(hào)以同樣的比例增大，吸光度值并不會(huì)改變，因而靈敏度不能提高。四、熒光分析法的應(yīng)用(一)無(wú)機(jī)化合物的分析大多數(shù)無(wú)機(jī)離子與溶劑之間的相互作用很強(qiáng)，其激發(fā)態(tài)多以非輻射躍遷方式返回基態(tài)，發(fā)熒光者甚少。然而很多無(wú)機(jī)離子可以與一些有機(jī)化合物形成有熒光的絡(luò)合物，利用這一性質(zhì)可對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定。目前采用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光分析的元素已近 70

19、 種，其中較常采用熒光法測(cè)定的元素有鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素等。能夠同金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物。它們通常含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的官能團(tuán)，能與金屬離子形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物。由于螯合物的生成，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，使原來(lái)不發(fā)熒光或熒光較弱的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光化合物。例如，熒光鎵在pH5.0 時(shí)與 Al 3+形成發(fā)射黃綠色熒光的絡(luò)合物,pH3.0 時(shí)與 Ga3+形成發(fā)射黃色熒光的絡(luò)合物；安息香在堿性介質(zhì)中與硼酸鹽形成發(fā)射綠藍(lán)色熒光的絡(luò)合物，與 Zn2+形成發(fā)射綠色熒光的絡(luò)合物；桑色素在堿性溶液中與 Be2+形成發(fā)射黃綠色熒光的絡(luò)合物等。熒光分析中

20、常用的另一類(lèi)絡(luò)合物是三元離子締合物。例如，羅丹明 B 為陽(yáng)離子熒光染料，Au3+、Ga3+ 、Tl 3+等陽(yáng)離子首先與Cl-、Br-等鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹明 B 締合形成熒光化合物。 再如，曙紅為陰離子熒光染料，Ag +與鄰菲咯啉形成的二元絡(luò)陽(yáng)離子，再與曙紅締合后可使其熒光猝滅，由熒光降低的程度也可對(duì)Ag+ 進(jìn)行分析。熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。除了上述Ag +外，可采用熒光猝滅法間接測(cè)定的離子還有F-、S2-、 Fe3+、Co2+ 、Ni 2+、 Cu2+等。(二)有機(jī)化合物約分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)生熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能

21、進(jìn)行熒光分析。如丙三醇與苯胺在濃硫酸介質(zhì)中反應(yīng)生成發(fā)射藍(lán)色熒光的喹啉，據(jù)此可以測(cè)定 0.1 的丙三醇。芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可以直接用熒光法測(cè)定。如在微堿性條件下，可測(cè)定0.001g·mL -1 以上的對(duì)氨基萘碘酸及05g·mL -1 的蒽。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴。 熒光分析法已成為員主要的測(cè)定方法。為了提高測(cè)定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后再進(jìn)行測(cè)定。例如，水楊酸與鋱形成絡(luò)合物后。熒光增強(qiáng)，測(cè)定靈敏度提高。再如，糖尿病研究中的重要物質(zhì)阿脲(四氧嘧啶 )與苯二胺反應(yīng)后，熒光增強(qiáng)，可用于測(cè)定血液中低至10-10 mol 阿脲

22、 。在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析領(lǐng)域，許多重要的分析對(duì)象，如維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類(lèi)和甾族化物、酶和輔酶等，均可用熒光法分析。由于熒光法的高靈敏度，它還用于生理過(guò)程中生物活性物質(zhì)之間的相互作用、生化物質(zhì)的變化以及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程的研究和監(jiān)視。第二節(jié)磷光分析法一、概述磷光是分子從亞穩(wěn)的三重態(tài)躍遷至基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。磷光分析法是以分子磷光光譜來(lái)鑒別有機(jī)化合和進(jìn)行定量分析的一種方法。 但是在 1975 年以前。絕大多數(shù)磷光分析工作都是在低溫條件下進(jìn)行的， 后來(lái)相繼出現(xiàn)了一些室溫磷光分析方法，如固體表面室溫磷光法、膠束增穩(wěn)室溫磷法和敏化室溫磷光法等分析方法，使磷光分析法在藥物分析、

23、臨床分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益發(fā)展，并與熒光分析相互補(bǔ)充，在有機(jī)定量分折中發(fā)揮出愈來(lái)愈重要的作用。二、基本原理(一)產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度前已述及，磷光是由處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。 由于分子的第一電子激發(fā)三重態(tài)(T1)的能量低于其第一電子激發(fā)單重態(tài)，因此，磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光更長(zhǎng)。三重態(tài) T1 向基態(tài) 0 屬自禁阻躍遷。躍遷速率小，使得三重態(tài)穩(wěn)定性大， 因而磷光比熒光有長(zhǎng)很多的壽命。當(dāng)激發(fā)光停止后，熒光立即消失，而磷則將持續(xù)一段時(shí)間(10-4 10s)三重態(tài)的壽命較長(zhǎng)，使得激發(fā)態(tài)分子發(fā)生T1S0 體系間竄躍這種非輻射躍遷的概率較大。因而，磷光物質(zhì)在室溫溶液中產(chǎn)生的磷光一般都比較弱。當(dāng)

24、磷光物質(zhì)濃度很小時(shí)，磷光強(qiáng)度Ip 與磷光物質(zhì)濃度c 之間的關(guān)系為Ip=2.3pI0kbc(56)式中： 為磷光效率， pI0為激發(fā)光的強(qiáng)度，k 為磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b 為試樣池的光程。在一定的條件下，、I 、ppk、b 均為常數(shù)，因此式(56)可寫(xiě)成Ip=Kc根據(jù)上式可以用磷光強(qiáng)度對(duì)磷光物質(zhì)濃度制作定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(二)溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響溶液中物質(zhì)的磷光強(qiáng)度與溫度有密切的關(guān)系。在室溫條件下，溶劑分子熱運(yùn)動(dòng)比較劇烈，絕大多數(shù)處于激發(fā)三重態(tài)的物質(zhì)分子均會(huì)與溶劑分子碰撞而失活，磷光很難產(chǎn)生。隨著溫度的降低，分子熱運(yùn)動(dòng)速率減慢，磷光逐漸增強(qiáng)。當(dāng)溶液在液氮中冷凍至玻璃狀時(shí)，某些物質(zhì)可以產(chǎn)生很強(qiáng)

25、的磷光。低溫磷光分析就是基于這一原理而建立起來(lái)的。對(duì)于吲哚、色氨酸和利血平等物質(zhì)，其低溫磷光分析法有比熒光法更高的靈敏度。(三)重原子效應(yīng)使用含有重原子的溶劑(如碘乙烷、溴乙烷 )或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質(zhì)的磷光強(qiáng)度，這種效應(yīng)稱作重原子效應(yīng)。前者稱為外部重原子效應(yīng)，后者稱為內(nèi)部重原子效應(yīng)。重原子效應(yīng)的機(jī)理是，重原子的高核電荷使得磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用。從而使S1T1 的體系間竄躍概率增大。有利于增大磷光效率。利用重原子效應(yīng)是提高磷光分析靈敏度的簡(jiǎn)單而有效的手段。 目前應(yīng)用較多的除重原子溶劑外，還可采用碘化物，Ag +鹽、 Pb2

26、+鹽和 Ti +鹽也有應(yīng)用。(四)室溫磷光在一般情況下，溶液中磷光物質(zhì)的室溫磷光太弱。不能用于分析。當(dāng)向溶液中加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣r(shí)，由于形成了表面活性劑膠束， 改變了磷光物質(zhì)的微環(huán)境，增強(qiáng)了定向約束力，從而減少了磷光分子與溶劑分子的碰撞概率。增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致磷光強(qiáng)度顯著增大，稱此為膠束增穩(wěn)室溫磷光。當(dāng)磷光物質(zhì)吸附于某些固體表面時(shí)，分子的剛性增加，三重態(tài)的碰撞去活化概率大大減小，也可在室溫下產(chǎn)生較強(qiáng)的磷光。由此又產(chǎn)生了固體表面室溫磷光分析方法。三、磷光分析儀器磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，也是由光源、激發(fā)單色器、液槽、發(fā)射單色器、檢測(cè)器和放大顯示裝置所組成。由于分析原理上的差別，磷

27、光分析儀器有些特殊部件。1試樣室測(cè)定低溫磷光一般在液氮溫度(77K) 下進(jìn)行，盛放試液的試樣池需放置在盛液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)。固體表面室溫磷光分析則需特制的試樣室。2磷光鏡有些物質(zhì)既產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。為了在有熒光現(xiàn)象的體系中測(cè)定磷光，常采用一種叫磷光鏡的機(jī)械切光裝置，利用熒光與磷光壽命的差異消除熒光干擾。現(xiàn)代的磷光分析儀多采用脈沖光源與程控檢測(cè)相結(jié)合的時(shí)間分辨技術(shù)。四、磷光分析法的應(yīng)用磷光分析法在藥物分析、臨床分析及環(huán)境分析領(lǐng)域得到了一定的應(yīng)用。它與熒光法互相補(bǔ)充，已成為痕量有機(jī)物分析的重要手段。低溫磷光分析已應(yīng)用于萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴以及含氮、硫和氧的雜環(huán)化合物分析，還用于阿司匹

28、林、柯卡因、磺胺密啶、維生策K 、B6、E 等許多藥物的分析。固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物快速靈敏的分析手段。膠束增穩(wěn)室溫磷光分析已用于萘、芘、聯(lián)苯的分析。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光分析法一、概述化學(xué)發(fā)光分析是利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。在化學(xué)發(fā)光中，發(fā)光物質(zhì)所需的激發(fā)能既不是光。也不是熱和電，而是由化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所提供的化學(xué)能?；瘜W(xué)發(fā)光現(xiàn)象自 19 世紀(jì)中期就為人們所熟知， 但應(yīng)用于分析化學(xué)卻是 20 世紀(jì)五六十年代的事。 1970 年左右。化學(xué)發(fā)光法被推薦作為監(jiān)測(cè)空氣污染物的方法。 70 年代后，液相化學(xué)發(fā)光分析得到快速發(fā)展。目前，這一方法已廣泛地應(yīng)用于

29、痕量元素分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及生物醫(yī)學(xué)分析等領(lǐng)域，成為一種重要的痕量分析手段。化學(xué)發(fā)光分析具有下列突出特點(diǎn)：(1)靈敏度很高。 例如，用熒光素酶和腺苷三磷酸 (ATP)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至 2×10-17mol/L ATP;利用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定 Cr3+,Co2+等離子的檢出限也低至 10-12g/mL 。(2)測(cè)定的線性范圍寬。一般有56 個(gè)數(shù)量級(jí)。(3)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單。化學(xué)發(fā)光分析儀沒(méi)有激發(fā)光源，由于不存在雜散光和散射光等引起的背景干擾，并且檢測(cè)的是整個(gè)光譜范圍內(nèi)的發(fā)光總量，因而也不需要單色器。(4)分析速度快。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析每小時(shí)可測(cè)定100個(gè)以上的試樣。二、基本原

30、理(一)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件化學(xué)發(fā)光的激發(fā)能由化學(xué)反應(yīng)所提供，在反應(yīng)過(guò)程中，某一反應(yīng)產(chǎn)物的分子接受反應(yīng)能被激發(fā)，形成電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)以輻射的形式將能量釋出來(lái)。這一過(guò)程可表示為A+B C?+DC?C+?能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)必須具備下述條件：(1)能快速地釋放出足夠的能量。根據(jù)E ?計(jì)算，在可見(jiàn)光區(qū)觀察到化學(xué)發(fā)光，需 170300 kJ ·mol-1 激發(fā)能。一些氧化還原反應(yīng)，特別是具有過(guò)氧化物中間產(chǎn)物的氧化反應(yīng)可滿足這種要求，(2)反應(yīng)途徑有利于激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的形成。(3)激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，或能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移給可以產(chǎn)生輻射躍遷的其它分子。(二)化學(xué)

31、發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光效率 定義為CL發(fā)射的分子數(shù)cl參加反應(yīng)的分子數(shù)rf(5-8)它等于生成激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率r和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率 f之乘積。激發(fā)態(tài)分子發(fā)射的光子數(shù)r參加反應(yīng)的分子數(shù)f激發(fā)態(tài)分子數(shù)化學(xué)效率 r主要取決于發(fā)光所依賴的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率 f的影響因素與熒光效率的影響因素相同。既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，亦受環(huán)境的影響。具有最高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體系中的化學(xué)發(fā)光，亦稱生物發(fā)光 (Bioluminescence)。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率很少超過(guò)0.01。被人們認(rèn)為是最有效的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的魯米諾反應(yīng)，發(fā)光效率也僅為0.010.5?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度 ICL 與反應(yīng)速率關(guān)

32、 dc 有如dt下關(guān)系：I CL (t )CLdc(5-9)dt由于化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度隨著時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小，如果反應(yīng)是一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，t 時(shí)刻的ICL (t)與該時(shí)刻分析物濃度 c 成正比，即化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度與分析物濃度成線性關(guān)系。在化學(xué)發(fā)光分析中，常用發(fā)光總強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量分析。為此，將式 (59)積分，得I CL dtdcCLdtdtCLc(5 10)由式 (5-10)得只，發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度成正比，因此，根據(jù)已知時(shí)間內(nèi)的發(fā)光總強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行化學(xué)分析的定量分析.(三)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類(lèi)型1. 液相化學(xué)發(fā)光 魯米諾在堿性溶液中被 H2O2、I2 等氧化劑氧化，可產(chǎn)生最大波長(zhǎng)為425nm

33、 波長(zhǎng)的光輻射。魯米諾在堿性溶液中化學(xué)發(fā)光.doc魯米諾在堿性溶液中化學(xué)發(fā)光.JPG除魯米諾外，光澤精、沒(méi)食子酸和洛粉堿等也可被氧化劑氧化產(chǎn)生液相化學(xué)發(fā)光。2氣相化學(xué)發(fā)光在氣相中， O3 能氧化 NO、乙烯等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，原子氧也能氧化SO2、 NO、CO 等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。例如：NO+O3 NO?+O2? NO2+ ?v2NO2( 600nm)CO+O CO2?CO2? CO2+ ?v( =300500nm)三、化學(xué)發(fā)光分析的儀器(一)分立取樣式儀器分立式化學(xué)發(fā)光分析儀是一種靜態(tài)下測(cè)量液相化學(xué)發(fā)光信號(hào)的裝置。 基本構(gòu)造如圖54 所示。先將試劑與試樣加入貯液管中，然后開(kāi)啟旋塞使溶液流入反應(yīng)池混合

34、，混合后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)立即發(fā)生。發(fā)光信號(hào)通過(guò)光倍增電管檢測(cè)，再經(jīng)放大后在記錄儀上記錄下來(lái)。分立式儀器具有簡(jiǎn)單、靈敏度高的待點(diǎn)，還可用于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究。但手工進(jìn)樣重復(fù)性差，測(cè)量的精密度不高，且難于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，分析效率也比較低。圖 5-04 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖.JPG圖 5-04 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .doc圖 5-4 分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖1- 反應(yīng)器 2- 反應(yīng)池 3- 恒溫水箱 4- 貯液管 5- 濾光片 6-光自倍增管圖 5-5 流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖R試劑載流S 一試液P 一蠕動(dòng)泵V 進(jìn)樣閥D 一化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(二)流動(dòng)注射式儀器流動(dòng)注射分析是一種自動(dòng)化溶

35、液分析技術(shù)。它是把一定體積的試液 (幾十至幾百微升 )注射到一個(gè)連續(xù)流動(dòng)著的載流中，試樣在流動(dòng)過(guò)程中分散、反應(yīng)，并被檢測(cè)。流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光分析儀如圖 5 5 所示。由蠕動(dòng)泵、進(jìn)樣閥、反應(yīng)盤(pán)管和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器組成。蠕動(dòng)泵的作用在于推動(dòng)載流在一細(xì)孔徑管道中連續(xù)穩(wěn)定地流動(dòng)。進(jìn)樣閥以重現(xiàn)性很高的方式把一定體積的試液注射到載流中，在流動(dòng)過(guò)程中，試液逐漸分散并與載流中的試劑發(fā)生反應(yīng)。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中，化學(xué)發(fā)光信號(hào)被光電倍增管檢測(cè)，經(jīng)放大后記錄下來(lái)。圖 5-05 流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .doc圖 5-05 流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖 .JPG由于流動(dòng)注射式儀器被檢測(cè)的光信號(hào)只是整個(gè)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線的一部分，必須根據(jù)反應(yīng)速率調(diào)整進(jìn)樣閥至檢測(cè)器之間的管道長(zhǎng)度或流速，以控制留存時(shí)間，使發(fā)光信號(hào)的峰值恰好被檢測(cè)，從而獲得最大靈敏度。四、化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用氣相化學(xué)發(fā)光已廣泛地應(yīng)用于大氣中 O3、NO、NO2 H2