第三章細胞生物學研究方法-1(2)

1、第三章第三章 細胞生物學研究方法細胞生物學研究方法第一節(jié)第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)第二節(jié) 細胞組分的分析方法細胞組分的分析方法第三節(jié)第三節(jié) 細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學顯微鏡技術(shù)一、光學顯微鏡技術(shù) (light microscopy)二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù) (Electro microscopy)三、掃描遂道顯微鏡三、掃描遂道顯微鏡 (Scanning tunneling microscope,STM ) 電子顯微鏡電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡掃描隧道

2、顯微鏡光學顯微鏡光學顯微鏡0.1nm1nm10nm100nm 1m100m1mm1cm10 m(一一)普通復式光學顯微鏡技術(shù)普通復式光學顯微鏡技術(shù)一、光學顯微鏡技術(shù)一、光學顯微鏡技術(shù)光學顯微鏡的組成部分：光學顯微鏡的組成部分：照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；光學放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成光學放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成機械裝置，用于固定材料和觀察方便。機械裝置，用于固定材料和觀察方便。光鏡樣本制作光鏡樣本制作:經(jīng)過固定劑因定、包埋、經(jīng)過固定劑因定、包埋、5m薄薄 切片、觀察切片、觀察常用的固定劑：甲醛等常用的固定劑：甲醛等常用的包埋劑：石蠟常用的包埋劑：石蠟分辨率：指區(qū)分

3、開兩個質(zhì)點間的最小距離。分辨率：指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。最大分辯率：最大分辯率：0.2m（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡（相差顯微鏡（phase contrast microscope）：）： 1932年年P(guān)Zernike發(fā)明，發(fā)明，1953年年,諾貝爾物理獎。諾貝爾物理獎。最大特點：可以觀察最大特點：可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞未經(jīng)染色的標本和活細胞?；驹恚喊淹高^標本的可見光的光程差變成振幅基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。變得清晰

4、可見。相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處：相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處： 1.環(huán)形光闌環(huán)形光闌(annular diaphragm):位于光源與聚光器之位于光源與聚光器之間。間。 作用作用:使透過聚光器的光線形成空心光錐使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上。焦聚到標本上。 2.相位板相位板(annular phaseplate):在物鏡中加涂有氟化鎂在物鏡中加涂有氟化鎂的相位板，將直射光或衍射光的相位推遲的相位板，將直射光或衍射光的相位推遲1/4。 A+相板：相板：將直射光推遲將直射光推遲1/4，兩組光波合軸后光波相，兩組光波合軸后光波相 加，振幅加大，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變加

5、，振幅加大，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變 亮，形成亮反差（或稱負反差）。亮，形成亮反差（或稱負反差）。 B+相板：相板：將衍射光推遲將衍射光推遲1/4，兩組光線合軸后光波相，兩組光線合軸后光波相 減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差）， 結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。微分干涉顯微鏡（微分干涉顯微鏡（differential interference microscope ） 1952年，年，Nomarski發(fā)明，適于研究發(fā)明，適于研究活細胞中較大活細胞中較大的細胞器。的細胞器。優(yōu)點優(yōu)點:能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，立體感特能顯示結(jié)構(gòu)的三維

6、立體投影影像，立體感特別強，適合于顯微操作別強，適合于顯微操作(基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因因)。原理原理:利用兩組平面偏振光的干涉，加強利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的影像的明暗效果明暗效果能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標本可厚一點，折射率差別更大，故影。標本可厚一點，折射率差別更大，故影像立體感更強。影像立體感更強。錄像增差顯微鏡技術(shù)（錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopy）計算機輔助的計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下顯微鏡可在高分辨率下研究活細胞中的顆粒細胞器的運動。研究活細胞中的顆粒細胞器的運動。(三三)熒光顯

7、微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)(Fluorescence Microscopy)原理與應(yīng)用：原理與應(yīng)用： 利用較短波長的光使樣品受到激火，產(chǎn)生較長利用較短波長的光使樣品受到激火，產(chǎn)生較長 波長的熒光，可作觀察和分辯樣品中產(chǎn)生熒光波長的熒光，可作觀察和分辯樣品中產(chǎn)生熒光 物質(zhì)的成分和位置。物質(zhì)的成分和位置。包括：直接熒光標記技術(shù)包括：直接熒光標記技術(shù);間接免疫熒光標記技術(shù)間接免疫熒光標記技術(shù) 在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性 定位：如綠色熒光蛋白定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用的應(yīng)用Singapores National Institute of

8、Education UKUniversity of Florida French SingaporeSouth Korea (四四)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser Scanning Confocal Microscopy ）原理與應(yīng)用：原理與應(yīng)用：利用共焦光路和激光掃描技術(shù)獲取生物樣品不同層利用共焦光路和激光掃描技術(shù)獲取生物樣品不同層面的圖像，再通過計算機組合成三維重構(gòu)的影像。面的圖像，再通過計算機組合成三維重構(gòu)的影像。排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率辨率(1.41.7(1.41.7倍倍) )，可重構(gòu)樣品的

9、三維結(jié)構(gòu)。，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。二、二、 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)（一）電子顯微鏡的基本知識（一）電子顯微鏡的基本知識（二）主要電鏡制樣技術(shù)（二）主要電鏡制樣技術(shù)（三）掃描電鏡（三）掃描電鏡 Scanning electron microscope，SEM Scanning probe microscope，SPM（一）（一）電子顯微鏡的基本知識電子顯微鏡的基本知識顯微顯微鏡鏡分辨分辨本領(lǐng)本領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理LMLM200nm200nm可見光可見光（400-700nm400-700nm） 玻璃玻璃透鏡透鏡不要求真空不要求真空利用樣品對光的吸收利用樣品對光的吸收形成

10、明暗反差和顏色形成明暗反差和顏色變化變化TEMTEM0.2nm0.2nm電子束電子束（0.01-0.9nm0.01-0.9nm）電磁電磁透鏡透鏡1.33x101.33x10-5-51.33x101.33x10-3-3PaPa利用樣品對電子的散利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反射和透射形成明暗反差差1.1.電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較2.2.電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較3.3.電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)Figure : Early images of cells. (A) Drawings of a living plant cell (a hair cell f

11、rom a Tradescantia flower), observed dividing into two daughter cells over a period of 2.5 hours by Eduard Strasburger in 1880. (B) A comparable living cell photographed recently through a modern light microscope. (B, courtesy of Peter Hepler.) （二）主要電鏡制樣技術(shù)（二）主要電鏡制樣技術(shù) 超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)(ultrathin section)：

12、用于電鏡：用于電鏡觀察的樣本制備觀察的樣本制備 。 固定樣品：鋨酸和戊二醛固定樣品：鋨酸和戊二醛包包 埋：環(huán)氧樹脂，埋：環(huán)氧樹脂，進進 樣：以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，樣：以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度：切片厚度：4050nm，染染 色：采用重金屬鹽染色，以增大反差。色：采用重金屬鹽染色，以增大反差。 負染色技術(shù)（負染色技術(shù)（Negative staining）：）： 負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金

13、屬鹽，而品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達分辨力可達1.5nm左右。左右。AB冰凍蝕刻技術(shù)（冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etchingFreeze etching）冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。膜質(zhì)雙分子膜質(zhì)雙分子層的疏水斷層的疏水斷鉑鉑碳碳快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etching）特點：特點：富有立體感富有立體感不需包埋不需包埋不需固

14、定不需固定保持樣品的真實結(jié)構(gòu)保持樣品的真實結(jié)構(gòu)主要用于觀察胞質(zhì)中的細胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白主要用于觀察胞質(zhì)中的細胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白4. 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié) 合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核射線晶體衍射技術(shù)及核 磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學 （Structural Biology）主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)

15、及其相互關(guān)系的 主要實驗手段主要實驗手段5. 掃描電鏡技術(shù)掃描電鏡技術(shù)掃描電鏡掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)電子電子“探針探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電電 子，探測器收集二次電子成象。子，探測器收集二次電子成象。CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面 張力問題張力問題三、三、 掃描遂道顯微鏡掃描遂道顯微鏡 （Scanning tunneling Microscope,STM）(80(80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器) ) 包括：包括：SPM

16、SPM、AFMAFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。 裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學反饋控制系統(tǒng)裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)

17、。和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。分辯率：分辯率：0.10.10.2nm;0.2nm;縱分辯率：縱分辯率：0.001nm0.001nm1000g10min20000g20min80000g1h150000g1h*g=1.12rn210-5r:半徑半徑;n:每分種旋轉(zhuǎn)數(shù)每分種旋轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)第二節(jié)細胞組分的分析方法第二節(jié)細胞組分的分析方法一、離心技術(shù)一、離心技術(shù)用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物蔗糖和甘油的最大密度為蔗糖和甘油的最大密度為1.3g/cm1.3g/cm3 3，所以只能用，所以只能用于分離在于分離在1.3g/cm1.3g/cm3 3以下的細胞

18、器或細胞結(jié)構(gòu)；而以下的細胞器或細胞結(jié)構(gòu)；而CsClCsCl的最大密度可達的最大密度可達1.9g/cm1.9g/cm3 3以上，可用于分離以上，可用于分離密度大于密度大于1.3g/cm1.3g/cm3 3的的DNADNA分子。分子。 * *在原理上在原理上, ,由于具有不同密度的顆粒隨由于具有不同密度的顆粒隨CsClCsCl密密度梯度的度梯度的形成重新分配形成重新分配，所以又稱為浮力密度離，所以又稱為浮力密度離心；而蔗糖和甘油則是在被離心的物質(zhì)在下降的心；而蔗糖和甘油則是在被離心的物質(zhì)在下降的過程中由于過程中由于密度的不同密度的不同而被阻止在不同的部位而被阻止在不同的部位, ,故是重力密度離心。

19、故是重力密度離心。密度梯度離心密度梯度離心densitycentrifugation二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法（細胞化學法）的顯示方法（細胞化學法） 原理原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布與位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布與含量。含量。DNA分布：分布： Feulgen反應(yīng)反應(yīng) 原理：切片先用稀鹽酸處理使原理：切片先用稀鹽酸處理使DNA，分子中脫，

20、分子中脫氧核糖與嘌呤之間的連接鍵打開，形成醛基，再與氧核糖與嘌呤之間的連接鍵打開，形成醛基，再與Schiff 試劑作用使細胞核試劑作用使細胞核DNA顯紫紅色。顯紫紅色。 *Schiff試劑：無色亞硫酸品紅復合物試劑：無色亞硫酸品紅復合物多糖的存在：多糖的存在：PAS（ periodic acid Schiff reaction ）原理：過碘酸的氧化作用先使糖分子的原理：過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇乙二醇基基 變?yōu)橐叶┗?，后者繼而與變?yōu)橐叶┗?，后者繼而與Schiff試劑結(jié)試劑結(jié) 合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。顏色反應(yīng)的深合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。顏色反應(yīng)的深 淺取決于組織內(nèi)多糖的乙二醇分子的多

21、寡。淺取決于組織內(nèi)多糖的乙二醇分子的多寡。蛋白質(zhì)的檢測：蛋白質(zhì)的檢測：Million反應(yīng)反應(yīng)原理：氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨原理：氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨 酸殘基反應(yīng)形成紅色沉淀。酸殘基反應(yīng)形成紅色沉淀。脂類脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂：脂類脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂：原理：標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。原理：標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅多用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍等溶于脂類的染料染、尼羅藍等溶于脂類的染料染色，使脂質(zhì)呈色。也可用四氧化鋨（色，使脂質(zhì)呈色。也可用四氧化鋨（OSO4）染色，）染色，脂肪酸或膽堿可使脂肪酸或膽堿可使OSO4還原為還

22、原為OSO2而呈黑色。而呈黑色。三、特異蛋白抗原的定位與定性（免疫細胞化學）三、特異蛋白抗原的定位與定性（免疫細胞化學）免疫熒光技術(shù)（免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique)：將免疫學方法與熒光標記技術(shù)相結(jié)：將免疫學方法與熒光標記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。合用來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。特點：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率特點：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。有限。蛋白電泳蛋白電泳(SDS-PAGE)與免疫印跡反應(yīng)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot) 。Get one more technique molecula

23、r biological analysisSouthern hybridization免疫電鏡技術(shù)：免疫電鏡技術(shù)： 免疫鐵蛋白技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù) 免疫酶標技術(shù)免疫酶標技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等骨架蛋白的定位等體外培養(yǎng)的體外培養(yǎng)的BHK21細胞經(jīng)選擇性抽提細胞經(jīng)選擇性抽提后用抗后用抗Mr280103核骨架蛋白抗體進行核骨架蛋白抗體進行免疫膠體金標記的結(jié)果免疫膠體金標記的結(jié)果LYTUCell Biology

24、四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)：用標記的核酸探針通過分子雜交確定特：用標記的核酸探針通過分子雜交確定特殊核苷酸序列要染色體上或細胞中的位置的方法稱為原殊核苷酸序列要染色體上或細胞中的位置的方法稱為原位雜交。位雜交。 光鏡水平的原位雜交技術(shù)（光鏡水平的原位雜交技術(shù)（in situ hybridization (同位素標記或熒光素標記的探針）同位素標記或熒光素標記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)（電鏡水平的原位雜交技術(shù)（in situ hybridization ） （生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連

25、的膠體金標記結(jié)合）標記結(jié)合）PLETHORA proteins as dose-dependent master regulators of Arabidopsis root development 1、PCR技術(shù)技術(shù) 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因?qū)τ谝阎炕虿糠趾塑账嵝蛄械幕?可以通過可以通過聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),以基因組以基因組DNA或或cDNA模板擴模板擴增得到目的基因片段。增得到目的基因片段。PCR指數(shù)期指數(shù)期對對始模板始模板進行定量。進行定量。（2）TaqMan法法490nm熒光熒光供體供體（CFP）430nm激發(fā)光激發(fā)光受體受體（YEPYEP）受體受體（YE

26、PYEP）490nm熒光熒光供體供體（CFP）430nm激發(fā)光激發(fā)光530nm黃色熒光黃色熒光FRET TaqMan法法Taq酶有酶有53外切核酸酶活性，可水解探針外切核酸酶活性，可水解探針引物濃度：引物濃度：50-900nM探針濃度：探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCR相同相同五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細胞五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài)內(nèi)的合成動態(tài) 利用放射性同位素的電離輻射對乳膠的感光利用放射性同位素的電離輻射對乳膠的感光 作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位 與半定位的一種細胞化學技術(shù)。與半

27、定位的一種細胞化學技術(shù)。 步驟步驟:同位素標記的生物大分子前體摻入；細胞內(nèi)同位素標記的生物大分子前體摻入；細胞內(nèi) 同位素所在位置的顯示。同位素所在位置的顯示。 六定量細胞化學分析技術(shù)六定量細胞化學分析技術(shù) 利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些 物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法包括：紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法流式細胞儀（流式細胞儀（Flow Cytometry）主要應(yīng)用：用于定量測定細胞中的主要應(yīng)用：用于定量測定細胞中的

28、DNA、RNA或某或某一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；的數(shù)量；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；分離分離DNA含量不同的中期染色體。含量不同的中期染色體。 第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作系統(tǒng)第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作系統(tǒng)一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)類型：動物細胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)細胞原代培養(yǎng)細胞(primary culture cell)：取下細胞、：取下細胞、組織的器官后立即進行培養(yǎng)組織的器官后立即進行培養(yǎng)(1-10代以內(nèi)代以內(nèi))。傳代培養(yǎng)細胞（傳代培養(yǎng)細胞（sub-cu

29、lture cell）：適應(yīng)在體）：適應(yīng)在體外培養(yǎng)的持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。外培養(yǎng)的持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。細胞株細胞株(cell strain):正常二倍體，接觸抑制正常二倍體，接觸抑制細胞系細胞系(cell line) :亞二倍體，接觸抑制喪失，亞二倍體，接觸抑制喪失，色體明色體明 顯改變，容易傳代培養(yǎng)。顯改變，容易傳代培養(yǎng)。 常用的細胞系：常用的細胞系：Hela細胞系細胞系(子宮頸瘤細胞子宮頸瘤細胞) BHK21(Baby hamster kidney) CHO(chinese hamster ovary)*培養(yǎng)細胞一般不保持體內(nèi)原有細胞形態(tài)，存在培養(yǎng)細胞一般不保持體內(nèi)原有細胞形態(tài)，存在形態(tài)：形

30、態(tài)： 成纖維樣細胞成纖維樣細胞(fibroblast like cell) 上皮樣細胞上皮樣細胞(epithelial like cell培養(yǎng)方法：貼壁培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)方法：貼壁培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)原代培養(yǎng)的步驟：原代培養(yǎng)的步驟： 取組織塊，剪碎，消化分散細胞連接處取組織塊，剪碎，消化分散細胞連接處(胰酶胰酶或或EDTA)，無菌、培養(yǎng)液中培養(yǎng)。，無菌、培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 細胞系細胞系(Cell line)：在培養(yǎng)條件下可進行無限分：在培養(yǎng)條件下可進行無限分裂的動物或植物細胞群。裂的動物或植物細胞群。 細胞株細胞株(Cell strain):通過選擇法或克隆形成法從通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細

31、胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標志志(Marker)的培養(yǎng)物稱為細胞株，細胞株的特定的培養(yǎng)物稱為細胞株，細胞株的特定性質(zhì)功標志必須在整個培養(yǎng)期始終保持。性質(zhì)功標志必須在整個培養(yǎng)期始終保持。貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng):分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分幾十分中至幾小時中至幾小時) 就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)，呈單層生長，所以此法壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)，呈單層生長，所以此法又叫單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細胞保持接觸抑制又叫單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細胞保持接觸抑制特性。特性。懸浮培養(yǎng)懸

32、浮培養(yǎng):懸浮培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，懸浮培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，一直懸浮在培養(yǎng)液中生長。如一直懸浮在培養(yǎng)液中生長。如T細胞的培養(yǎng)。懸浮細胞的培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件較為復雜，難度也大一些，但是容易同時培養(yǎng)條件較為復雜，難度也大一些，但是容易同時獲得大量的培養(yǎng)細胞。獲得大量的培養(yǎng)細胞。w植物細胞植物細胞類型：單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）類型：單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) （體細胞培養(yǎng)）（體細胞培養(yǎng)） w非細胞體系（非細胞體系（cell-free system） LYTUCell Biology二、細胞工程二、細胞工程細胞分化的定向誘導：細胞分化的定向誘導： 基因工程基因

33、工程 組織工程組織工程細胞融合：細胞融合： 雜種細胞雜種細胞 單克隆抗體單克隆抗體顯微注射顯微注射 克隆動物克隆動物2. 細胞融合技術(shù)：脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命(Khler和Milstein, Jerne)1984年Nobel生理學及醫(yī)學獎脾細胞脾細胞(B淋巴細胞淋巴細胞)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞雜交瘤細胞脾細胞脾細胞/ 脾細胞脾細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞/ 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞脾細胞脾細胞篩選出篩選出不能長期存活不能長期存活不能長期存活不能長期存活HAT培養(yǎng)基篩選原理培養(yǎng)基篩選原理內(nèi)源性途徑內(nèi)源性途徑(主要途徑主要途徑 谷氨酰胺谷氨酰胺 or單磷酸尿苷酸單磷酸尿苷酸外源性途徑外源性途徑(旁路途徑旁路途徑) (Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase) 次嘌呤次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (Thymidine kinase, TK)B淋巴細胞：淋巴細胞： HGPRT+， TK+骨髓瘤細胞：骨髓瘤細胞： HGPRT-， TK-存活存活死亡死亡外源性途徑外源性途徑(旁路途徑旁路途徑)漿細胞自漿細