漿膜腔積液細胞學檢查質(zhì)量控制

1、漿膜腔積液細胞學檢查質(zhì)量控制    The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.    【關鍵詞】  腫瘤;細胞學技術;漿膜腔積液漿膜腔積液常作為某些疾病的伴隨癥狀或首發(fā)癥狀出現(xiàn)，臨床常通過漿膜腔積液檢查鑒別積液的良惡性、明確病因。目前，漿膜腔積液細胞學檢查找到腫瘤細胞，仍是鑒別漿膜腔積液良惡性的一種快速、準確、可靠和經(jīng)濟的首選方法。因常規(guī)離心沉淀法檢出腫瘤細胞的陽性率僅為33%60%左右12，所以多年來，

2、漿膜腔積液細胞學檢查方法不斷創(chuàng)新和加強各環(huán)節(jié)質(zhì)量控制以提高腫瘤細胞的檢出率，受到越來越多的臨床實驗室的關注。1 分析前的質(zhì)量控制It is right to put everything in its proper use.  1.1 標本采集The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.  1.1.1 采集方式 對大量漿膜腔積液者應留取最后抽出、帶有較多漿膜腔脫落細胞的積液做細胞學檢查()。薛立福介紹3，在胸腔積液采集中可將先

3、抽入注射器的積液再快速推向胸腔底部，反復數(shù)次后抽取送檢，可使腫瘤細胞檢出率由50%左右提高為80.3%。Silence in times of suffering is the best.  1.1.2 抗凝 采集脫落細胞學檢查標本時應加入抗凝劑，一般多為肝素300U/100mL標本，或用109mmol/L枸櫞酸鈉(標本與抗凝劑比例為101)，是提高腫瘤細胞檢出率的一個重要環(huán)節(jié)而不可忽視。1.2 送檢Call no man happy until he dies.  1.2.1 送檢標本量 送檢標本量直接關系到可收集到的腫瘤

4、細胞量，多數(shù)研究者建議為200mL左右。李志忠等4將116例胸腔積液標本分為100300mL組與510mL組做對比，結果腫瘤細胞檢出率分別為83.6%與46.6%，差異顯著(P<0.005);抽出不足100mL者送檢510mL，腫瘤細胞檢出率僅為14.3%，除標本量過少外，也與患者的病情相關。李亞紅等5將250mL標本靜置30min后取底層積液5mL離心沉淀，腫瘤細胞檢出率為83.3%，如不靜置檢出率為52%。值得關注的是不少文獻報道不管送檢標本量多少，只取520mL離心沉淀1，3，5。筆者建議留取新鮮標本100200mL全部離心沉淀，保證收集到盡量多的腫瘤細胞，這是提高腫瘤細胞檢出率的

5、一個關鍵環(huán)節(jié)(教育學/職業(yè)教育論文 )。靜置一定時間后取底層標本離心沉淀，雖腫瘤細胞檢出率與離心沉淀100300mL標本一致，但因時間延長，細胞形態(tài)改變而影響細胞識別及診斷，不應作為最佳選擇。Joy put heart into a man.  1.2.2 送檢時間 高自芳等6采用圖像分析儀對離體后室溫放置15min、30min、60min、90min、120min后的漿膜腔積液細胞形態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)15min組細胞結構清晰，核著色深、染色質(zhì)及核膜清楚;30min與60min組細胞略增大，結構尚清晰，染色質(zhì)較15min組模糊而核膜尚清;90min與120min組細

6、胞面積明顯增大，結構模糊不清，部分細胞破碎，特別是120min組的細胞面積是15min組的3倍。因此認為15min內(nèi)完成送檢、處理、固定最佳，而60min內(nèi)完成送檢、處理、固定仍尚可。考慮送檢及實驗室內(nèi)標本處理、固定用時，30min內(nèi)送檢、60min內(nèi)完成標本處理和固定為必須。1.2.3 送檢次數(shù) 增加送檢次數(shù)可提高腫瘤細胞檢出率，各文獻報道結論一致14，三次及三次以上送檢與一次送檢腫瘤細胞的檢出率差異具有顯著性(P<0.01)。2 分析過程的質(zhì)量控制2.1 腫瘤細胞收集目前常用的漿膜腔積液細胞學檢查5種收集方法，其方法學的創(chuàng)新和質(zhì)量控制目的均為提

7、高腫瘤細胞收集率。  2.1.1 常規(guī)離心沉淀法 離心沉淀的相對離心力(RCF)和血性積液的處理是該方法的兩個關鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)。不同研究中離心沉淀所用轉(zhuǎn)速、時間各異，轉(zhuǎn)速5003 500r/min、離心時間530min不等。但多數(shù)文獻未說明離心機的有效離心半徑，所以RCF(g)不明RCF(g)=1.118×10-5×有效離心半徑(cm)×(r/min)2。尿沉渣檢查離心RCF為400g/5min，溫氏法血細胞比容測定RCF為2 260g/30min，分離乏血小板血漿RCF為1 570g/10min，分離血清R

8、CF為1 010g/5min左右。惡性漿膜腔積液70%以上為漿液性7，其粘稠度大于尿液而小于血液，漿膜腔積液中腫瘤細胞體積又大于紅細胞。因此，收集積液中腫瘤細胞時的RCF為1 000g左右較為合適，時間根據(jù)漿膜腔積液性狀選擇510min。目前國產(chǎn)離心機大部分有效離心半徑為1415cm，RCF1 000g時，轉(zhuǎn)速為2 500r/min左右。離心沉淀既要避免RCF過小和離心時間過短收集不到腫瘤細胞，又要避免過大和時間過長導致細胞形態(tài)異常變化和破碎。血性積液直接涂片，腫瘤細胞檢出率僅為11%7;離心后取白膜層制片811腫瘤細胞檢出率50%左右;許成英11用草酸

9、銨1.2g、90%酒精30mL、甘油10mL加水至100mL低滲溶液與胸水11破壞紅細胞后，腫瘤細胞檢出率由52%提高為86%;支喜蘭12比較了蒸餾水、6g/L氯化鈉溶液和低滲氯化鉀+甲醇+冰醋酸溶液3種破壞紅細胞的效果，結果為低滲氯化鉀+甲醇+冰醋酸溶液紅細胞破壞完全而有核細胞形態(tài)保持最好。Early mistakes are the seeds of future trouble.  2.1.2 腦脊液細胞玻片離心沉淀器法 進行漿膜腔積液細胞學檢查，標本用量僅為0.10.5mL，低速離心而細胞收集率高，損失少;制片好，細胞形態(tài)保持完整易于觀察，避免了常規(guī)高速離

10、心導致的腫瘤細胞發(fā)生變形破碎的可能13。張紀云等14取靜置后底層的漿膜腔積液用該法檢查40例惡性積液，腫瘤細胞檢出率為97.5%，而常規(guī)離心法為80%，兩種方法相比差異有顯著性(P<0.05)。該法質(zhì)控需注意各步驟操作準確和離心速度不能過快。2010年2月張樹平等：漿膜腔積液細胞學檢查質(zhì)量控制第1期2010年2月河北北方學院學報(醫(yī)學版)第1期2.1.3 密度梯度離心法 朱任之等1516將抽取的胸腔積液離心沉淀后，以適量PBS混懸后，加到兩倍量的淋巴細胞分離液(比重1.055)的表面，2 000r/min離心1520min，收取細胞分離液表面細胞層檢查，并依

11、檢測結果決定檢測次數(shù)，最多3次。36例惡性胸腔積液的腫瘤細胞檢出率達91.7%，而常規(guī)離心法為44.1%(P<0.005)。葉安霞8、馬吉勇等16用無鈣、鎂離子Hanks液洗滌處理離心沉淀物后混懸，加入到淋巴細胞分離液表面后離心沉淀，一次檢測結果的陽性率分別為78%和65%，均高于常規(guī)離心法的30%和45%。三位作者腫瘤細胞檢出率相差較大，可能為其檢測次數(shù)不一致所導致。2.1.4 腫瘤細胞采集器法 又稱膜式腫瘤細胞采集術或一次性腫瘤細胞采集器法。該法使用的采集器由入液管、濃縮器、單向閥、三通及出液管組成，其中濃縮器中部夾有微孔濾膜，微孔直徑為10m。腫瘤細胞直徑一般均

12、大于10m，而淋巴細胞、紅細胞因直徑小于10m被濾過。漿膜腔積液經(jīng)抽濾后，取下微孔濾膜涂片。因該法不用離心沉淀，又可處理較大量積液收集腫瘤細胞，無大量淋巴細胞和紅細胞干擾，背景清晰，腫瘤細胞檢出率明顯提高。該法適用各類體液和沖洗液的細胞學檢查，因其快速簡便而常用于術中漿膜腔積液、灌洗液細胞學檢查，腫瘤細胞檢出率明顯高于常規(guī)離心法(P<0.005)，多在70%90%之間1720。該法已被國內(nèi)各級臨床實驗室廣泛采用。該法的標本送檢量和標本抗凝對提高腫瘤細胞的檢出率至關重要，并要避免抽濾時和濾過膜細胞面涂片時用力過大或不均引起細胞變形。Take a pain for a pleasure al

13、l wise men can.  2.1.5 液基細胞學技術 液基細胞學技術于1996年5月獲美國FDA批準用于婦科細胞學檢查，我國在1998年引進。目前使用的液基細胞學技術有兩種21，即新柏氏液基薄層細胞學檢查(Thinprep cytology test，TCT)和自動細胞學檢查(autocyte prep cytology tset，又稱Liqiudbased cytology test，LCT)兩種系統(tǒng)。TCT與LCT的制片原理略有不同，TCT是通過高速旋轉(zhuǎn)將細胞打散，然后吸附到具有35

14、萬個小孔(孔徑58m)的過濾膜上去除雜質(zhì)后，利用靜電吸附原理將細胞制成直徑20mm薄層涂片。LCT是利用不同類型細胞的比重差異，將分層液加到保存液中，用離心機離心，將有診斷價值的細胞、病原體與標本中的粘液、淋巴細胞、紅細胞分離，把篩選出的細胞制成直徑13mm薄層涂片。國內(nèi)已有不少醫(yī)療機構的臨床實驗室將液基細胞學技術用于漿膜腔積液細胞學檢查。該方法仍需先用常規(guī)離心沉淀法收集細胞，將沉淀物清洗一次后加入Cytolyty液中。由于該法所制成的涂片總體采集量增加，細胞集中、完整，讀片面積小和背景清晰，腫瘤細胞檢出率明顯提高，與常規(guī)離心法比較差異有顯著性(P<0.01)2224。質(zhì)量控制的關鍵環(huán)節(jié)

15、為取材的質(zhì)量，包括部位選擇、手法輕重等因素，取樣不足是液基細胞學假陰性診斷的最主要原因;其次是標本中因血液、粘液多而不做處理，使制片質(zhì)量不理想，出現(xiàn)假陰性結果25。Know thyself.  通過對5種細胞收集方法的比較，作者認為以腫瘤細胞采集器法優(yōu)點最多，包括簡便、快速、經(jīng)濟、處理標本量大和可消除背景干擾，使腫瘤細胞檢出率明顯提高，適合多種體液的細胞學檢查等，建議作為漿膜腔積液細胞學檢查腫瘤細胞收集的首選方法。其次為腦脊液細胞玻片離心沉淀器法。常規(guī)離心法在做好從標本采集開始各個檢查環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制的基礎上，仍可為漿膜腔積液細胞學檢查的一種較好方法。該法還可通過對其他細胞及特殊結構的

16、觀察，幫助判斷積液的性質(zhì)。密度梯度離心法，操作相對繁瑣和同樣需對各檢查環(huán)節(jié)進行嚴格質(zhì)量控制。液基細胞學技術優(yōu)點突出，但需專門設備和檢查成本升高，且用于漿膜腔積液細胞學檢查的時間還不長，值得我們今后做更多的探討。 論文教育信息網(wǎng)  2.2 制片方法及制片數(shù)量離心沉淀物或抽濾濃縮物的制片方法有涂抹法、壓片法、推片法和自動細胞離心涂片機法。涂片、壓片法易致厚薄不均，細胞重疊而影響觀察，樓煥進25建議推片為好，還有的作者建議推厚涂片和薄涂片各數(shù)張4。高質(zhì)量的制片是后期染色及形態(tài)學觀察的良好基礎。制片數(shù)量 增加制片及檢查數(shù)量，可提高腫瘤細胞檢出率。一般文獻均為31

17、0張4，7，9，26，至少2張11。Everybody's business is nobody's business.  2.3固定 制片后固定與染色方法相關，一般HE染色均需專門進行固定，固定的好壞直接影響到染色效果及鏡檢診斷。HE染色的固定液有幾種配方及固定時間：無水酒精(或5%酒精)/15min;甲醇冰醋酸(3：1)/20min;95%酒精乙醚(11)/15min;95%酒精乙醚冰醋酸混合液(50501)/15min;AAF/30min;400g/L甲醛/5min。混合類固定液固定效果更好。2.4 染色 細胞染色方法有HE、瑞姬氏

18、染色和巴氏染色等，使用HE染色占第1位，其次是瑞姬氏染色。2.4.1 瑞姬氏染色(或劉氏染色) 該染色方法簡單、試劑易得，除對腫瘤細胞的染色效果好使之易識別外，還對漿膜腔脫落的間皮細胞、各種血細胞、淋巴瘤細胞、細胞的吞噬現(xiàn)象、免疫島、紅斑狼瘡細胞、血細胞黏附腫瘤細胞花環(huán)現(xiàn)象、真菌、寄生蟲有較好的染色效果而易識別，對分析鑒別積液性質(zhì)和判斷預后很有幫助2728。如由檢驗科負責，多用瑞姬氏染色。2.4.2 HE染色 病理學檢查多用此染色法，優(yōu)點為細胞核結構清晰。漿膜積液細胞學檢查由病理科負責，習慣用此染色。兩類染色方法各有其優(yōu)點，質(zhì)量控制的要點均為染液的配制質(zhì)

19、量和制片的質(zhì)量。筆者推薦一般基層醫(yī)院用瑞姬氏染色方法。2.5 鏡檢 鏡檢觀察是檢查的最后關鍵環(huán)節(jié)，應仔細認真完成。一般要求二步掃描法4，26：先用低倍鏡掃描觀察全片：重點對涂片尾部及邊緣部位進行觀察;發(fā)現(xiàn)可疑細胞后，轉(zhuǎn)換油鏡鑒定細胞性質(zhì)。每份標本至少鏡檢23張涂片，如未找到腫瘤細胞分類計數(shù)500個有核細胞，分析判斷積液性質(zhì)。據(jù)吳茅等29通過漿膜腔積液細胞涂片照片調(diào)查84家二、三級醫(yī)院的臨床實驗室，第一次對腫瘤細胞、淋巴瘤細胞、核異質(zhì)細胞、多倍體細胞識別的正確率分別為57.4%、26.2%、26.2和30.4%，經(jīng)培訓后，第三次調(diào)查分別提高為67.5%、54.4%、53%和5

20、4.4%，說明了漿膜腔積液內(nèi)細胞識別能力低是國內(nèi)各級醫(yī)院臨床實驗室普遍存在的問題。3 建議Still waters have deep bottoms.  3.1 必須加強漿膜腔積液細胞學檢查的分析前質(zhì)量控制工作，由醫(yī)療機構牽頭制定規(guī)范性的操作規(guī)程，加強分析前的標本采集、抗凝、送檢時間、次數(shù)等各重點環(huán)節(jié)協(xié)作和質(zhì)量控制工作。3.2 優(yōu)選漿膜腔積液中腫瘤細胞的收集、檢查方法為漿膜腔積液細胞學檢查質(zhì)量控制的首要任務。各實驗室應根據(jù)自身的條件，積極引進腫瘤細胞檢出率高的方法，并制定相應嚴格的操作規(guī)程，加強質(zhì)量控制。在標本處理、制片、固定、染色、鏡檢各個環(huán)節(jié)上嚴格

21、遵守操作規(guī)程。3.3 建議各級臨床檢驗中心大力開展?jié){膜腔積液細胞學檢查的室間質(zhì)量評價活動，并開辦相關的培訓班、研討班，特別要加強對漿膜腔積液內(nèi)細胞識別能力的培訓，盡快提高臨床實驗室漿膜腔積液細胞學檢查的質(zhì)量。【參考文獻】  1 樊英，李龍蕓.良惡性胸腔積液的鑒別診斷J.癌癥進展雜志，2005，3(2)：134136.2 李桂賓，孫玉紅，高穎.良惡性胸水的實驗室檢查新進展J.臨床肺科雜志，2005，10(3)：361362.3 薛立福.惡性胸腔積液檢測方法及評價J.中華結核和呼吸雜志，2001，24(1)：1819.4 李志忠

22、，劉錫范，李新香.胸腔積液細胞學檢查方法的對比研究J.中華全科醫(yī)師雜志，2004，3(1)：76.5 李亞紅，李亦民，袁古治，等.改良胸水常規(guī)細胞學檢查的臨床應用價值J.臨床醫(yī)學，2001，21(10)：5455.6 高自芳，曹曉哲，董亮，等.送檢時間對脫落細胞形態(tài)影響的定量研究J.臨床與實驗病理學雜志，2000，16(4)：345.7 常正義，潘云.580例漿膜腔積液脫落細胞學檢查分析J.右江民族醫(yī)學院學報，2002，24(5)：745746.8 葉安霞，向旭東，譚國姣，等.密度梯度離心法在癌性胸腔積液細胞病理學檢測中的應用J.中華結核和呼吸雜志，20

23、01，24(7)：420.9 靳英，尤利霞.惡性腫瘤患者胸腹水細胞學診斷探討J.實用醫(yī)技雜志，2004，11(5)：730.10曹敏，魏紅權，陳培輝.477例擬診癌癥患者胸腹水細胞學診斷探討J.實用腫瘤雜志，2003，18(4)：304305.11許成英.提高胸腹水細胞學檢查陽性率方法探討J.浙江腫瘤，2000，6(1)：6162.12支喜蘭.血性胸腹水脫落細胞學檢查涂片方法的比較J.診斷病理學雜志，2003，10(1)：10491050.13姜貴發(fā)，范曉紅，邊振梅，等.腦脊液細胞玻片離心法與常規(guī)涂片法對癌性胸水診斷價值的探討J.航空航天醫(yī)藥，1996，7(1):78.14張紀云，高菊興.腦脊液細胞玻片沉淀器在漿膜腔積液細胞學檢查中的應用J.臨床檢驗雜志，1993，11(2)：96.15朱任之，郭胤仕.密度梯度離心法檢測脫落腫瘤細胞對惡性胸腔積液的診斷價值J.蘭州大學學報:自然科學版，1996，32(4)：137141.16馬吉勇，龐玉瑛，王明麗，等.惡性胸腹水細胞的分離、純化及臨床意義J.安徽醫(yī)科大學學報，2002，37(2)：132134.17郭梅，王瑾，郝俊杰，等.惡性胸腹水細胞學檢查方