螺旋藻多糖對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖及促進(jìn)IFN-γ的誘生作用

1、螺旋藻多糖對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖及促進(jìn)IFN-的誘生作用         【摘要】  目的觀察螺旋藻多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用和細(xì)胞因子IFN-的影響，探討其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。 方法選擇健康的雄性昆明種小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺制備免疫低下小鼠模型。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；酶聯(lián)免疫法測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-的濃度。 結(jié)果用藥組小鼠脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞增殖OD值及小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-值與模型對(duì)照組相比均有顯著性差異（P0.05或P0.01）。結(jié)論螺旋藻多糖能夠促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增

2、殖，并通過(guò)誘生IFN-而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。 【關(guān)鍵詞】  螺旋藻多糖 免疫低下 淋巴細(xì)胞增殖 -干擾素Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Spirulina platensis polysaccharide on lymphocyte proliferation and IFN- induction in immunosuppressive model mice caused by cyclophosphamide. MethodsHealthy male Kunming mice were induced to establish

3、immunosuppressive model by the peritoneal injection of Cyclophosphamide. MTT colorimetry was used to examine the cell proliferation of spleen cell and thymus cell. IFN- concentration of cultural supernatant from spleen cell was determined by enzyme linked immunosorbent assay.ResultsCompared with the

4、 model group, the lymphocyte proliferation and IFN- production were increased significantly in PSP groups (P0.05,0.01).ConclusionPolysaccharide from Spirulina platensis has immune regulative effect by promoting the cell proliferation and IFN- induction.Key words:Polysaccharide from Spirulina platens

5、is;   immunosuppression;   Lymphocyte proliferation;   IFN-螺旋藻多糖(polysaccharide from Spirulina platensis, PSP)是從螺旋藻中提取的一種酸性、水溶性的雜多糖，除了具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還具有多種生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能，如：抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗輻射等作用，已成為國(guó)內(nèi)外藥物研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)觀察了PSP對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞的增殖情況及其對(duì)IFN-的誘生作用，為闡明PSP的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  器

6、材與方法1  材料1.1  螺旋藻多糖的提取 采用改良的三氯乙酸去蛋白法從螺旋藻中提取出的粗多糖，硫酸蒽酮法測(cè)定糖含量為90%以上。1.2   動(dòng)物 昆明種小鼠（KM小鼠），雄性，68周齡，體重1822 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2  試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO產(chǎn)品）；新生牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；ConA（Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT, Sigma公司）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物公司），其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀：ELx8009（BIO-TEK公司

7、）。3  動(dòng)物模型分組、制備及給藥方法取健康昆明小鼠50只，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)和3組不同濃度螺旋藻多糖模型組(C，D，E組)，每組10只。A組每只小鼠腹腔注射生理鹽水1 ml/d，連續(xù)10 d；B，C，D和E組每只小鼠先腹腔注射環(huán)磷酰胺2 mg/d，連續(xù)3 d，第4天開(kāi)始分別注射生理鹽水和不同濃度的螺旋藻多糖，連續(xù)7 d；觀察免疫低下模型組小鼠與正常對(duì)照組小鼠比較，活動(dòng)度降低、毛皮顏色較暗、無(wú)光澤等，表明造模成功。4   檢測(cè)指標(biāo)4.1  小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌條件下拉頸處死小鼠，取出脾臟和胸腺，去脂肪和結(jié)締

8、組織，分別放入盛有適量RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，剪碎置于培養(yǎng)皿中，用毛玻璃輕輕研磨，使細(xì)胞懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中，然后用8層無(wú)菌紗布濾出單細(xì)胞懸液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗兩次，將洗過(guò)的細(xì)胞懸液懸浮于含10%新生小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染料計(jì)數(shù)細(xì)胞的活細(xì)胞率為95%以上。4.2  小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，脾細(xì)胞2×105/孔、胸腺細(xì)胞4×106/孔，然后每孔加入5 g/ml ConA 50 l，六復(fù)孔培養(yǎng)，于37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h后，加入5 g/ml MTT

9、10 l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入三聯(lián)液100 l/孔，混勻，放置過(guò)夜，次日用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度OD570nm值。4.3   對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-的影響將脾細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，5×105/孔，在37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集上清，凍存于-20。根據(jù)ELISA試劑盒方法說(shuō)明操作，測(cè)定IFN-的含量。         5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用±s表示，應(yīng)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。2  結(jié)果2.1 

10、60; 螺旋藻多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠脾細(xì)胞/胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響  結(jié)果見(jiàn)表1。表1  螺旋藻多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠脾細(xì)胞/胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(略)表1結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的脾細(xì)胞增殖OD值顯著降低（P0.01），胸腺細(xì)胞增殖OD值顯著降低（P0.01），說(shuō)明制備免疫低下模型成功。高、中、低劑量螺旋藻多糖可顯著促進(jìn)免疫低下小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖（P0.05或0.01）。2.2   螺旋藻多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-的影響  結(jié)果見(jiàn)表2。表2  螺旋藻多糖對(duì)

11、環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-的影響(略)表2結(jié)果表明，與模型組相比，高、中、低劑量螺旋藻多糖組均可促進(jìn)免疫低下小鼠分泌 IFN-（P0.05或P0.01）3  討論普遍認(rèn)為多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有無(wú)細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，來(lái)源不同的多糖對(duì)機(jī)體的免疫功能具有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠分別或同時(shí)激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫，被認(rèn)為是一種重要的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。螺旋藻多糖是一種無(wú)毒性的水溶性酸性多糖，其分子量約為12 00016 000，是由多種單糖組成的雜多糖。小鼠腹腔注射螺旋藻多糖能明顯增

12、加脾重，顯著促進(jìn)小鼠血清溶血素的形成和提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)1；螺旋藻由于其高濃度的營(yíng)養(yǎng)成分使其具有多種生物活性和營(yíng)養(yǎng)作用，具有生物調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)的功能。不同的螺旋藻制劑能夠影響免疫系統(tǒng)，如增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性、刺激抗體和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、提高組織中NK細(xì)胞的積聚、提高NK細(xì)胞的殺傷能力以及激活、活化T、B淋巴細(xì)胞2,3。Al-Batshan HA等4研究發(fā)現(xiàn)螺旋藻能夠增強(qiáng)雞的單核巨噬細(xì)胞功能，從而增強(qiáng)雞的抗病能力。Hirahashi等5采用熱水抽取法提取螺旋藻多糖，并研究發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。胸腺和脾臟是機(jī)體的重要免疫器官。一些免疫增強(qiáng)劑可以使胸腺和脾臟增重，而免疫抑制

13、劑則可使其萎縮。免疫器官細(xì)胞增殖分化受到抑制，就會(huì)使機(jī)體淋巴細(xì)胞總數(shù)降低，從而使機(jī)體免疫功能下降。環(huán)磷酰胺是較強(qiáng)的烷化劑，可殺傷各種免疫細(xì)胞，抑制各種動(dòng)物的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答6，使CD4+T細(xì)胞明顯抑制，導(dǎo)致免疫抑制小鼠IFN-分泌降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺能夠明顯抑制小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的增殖和脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-，說(shuō)明制備免疫低下模型成功。運(yùn)用MTT法檢測(cè)了正常對(duì)照組、模型組及螺旋藻多糖治療各劑量組小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)用螺旋藻多糖治療各劑量組均能逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺引起的脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖抑制，顯著促進(jìn)脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖，說(shuō)明 PSP能明顯增強(qiáng)環(huán)磷酰胺處理的小鼠淋巴

14、細(xì)胞對(duì)ConA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化能力，從而提高了免疫細(xì)胞的免疫活性。IFN-是一種主要由Th1細(xì)胞分泌或旁分泌的細(xì)胞因子，可通過(guò)活化NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性。PSP能夠促進(jìn)環(huán)磷酰胺處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-的分泌，說(shuō)明PSP可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌而影響機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明螺旋藻多糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖功能和影響細(xì)胞因子的分泌來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，有助于進(jìn)一步說(shuō)明PSP的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，對(duì)PSP進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1左紹遠(yuǎn),朱正宇,馬澗泉.螺旋藻多糖( PSP) 對(duì)免疫功能的影響J.藥物生物技術(shù),199

15、6 ,3 (3) ：158.2Khan Z, Bhadouria P, Bisen PS. Nutritional and therapeutic potential of SpirulinaJ. Curr Pharm Biotechnol , 2005 ,6(5):373.3涂芳,楊 芳,鄭文杰,等. 螺旋藻多糖的研究進(jìn)展J.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2005,17(1):115.4Al-Batshan HA, Al-Mufarrej SI, Al-Homaidan AA, Qureshi MA. Enhancement of chicken macrophage phagocytic function and nitrite production by dietary Spirulina platensis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2001 ,23(2):281.5Hirahashi T, Matsumoto M, Hazek