淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測 醫(yī)學論文

1、    淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測 醫(yī)學論文              本文由中國論文范文收集整理。 【摘要】   目的：建立預處理淋巴細胞樣品后經(jīng)高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺（catecholamines，CAs）的 方法 ，并為淋巴細胞合成和釋放CAs提供直接的證據(jù)。方法：淋巴細胞培養(yǎng)液上清經(jīng)氧化鋁吸

2、附，高氯酸洗脫；淋巴細胞經(jīng)破細胞，去蛋白，高氯酸提??；采用AtlantisC18反相色譜柱分離淋巴細胞培養(yǎng)液上清以及細胞中的CAs，電化學檢測器檢測。結果：CAs分離效果良好，22 min內(nèi)完成測定，各峰形對稱，雜質(zhì)峰少。用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導的淋巴細胞培養(yǎng)液上清中去甲腎上腺素含量最高，其次是多巴胺，腎上腺素最少；而Con A刺激的淋巴細胞內(nèi)多巴胺的含量最高，其次為去甲腎上腺素，腎上腺素最少。結論：對淋巴細胞樣品進行預處理能提高HPLC檢測的靈敏度、減少干擾，這種方法可直接檢測到淋巴細胞合成和釋放CAs。 【關鍵詞】   淋巴細胞；兒茶酚胺；高效

3、液相色譜法       Objective: To establish an improved method in order to effectively determine levels of catecholamines (CAs) including norepinephrine (NE), epinephrine (E) and dopamine (DA) in the cultured lymphocytes and in the supernatants of the cultures by high performance li

4、quid chromatography(HPLC). Methods: The CAs were extracted from lymphocytes by ultrasonication and from the extracellular medium by alumina absorption. Atlantis C18 column with electrochemical detection to was used simultaneously determine NE, E and DA in lymphocytes and the extracellular medium. Re

5、sults: CAs including DA, NE and E in the concanavalin A(Con A)-activated lymphocytes and their supernatants were able to be determined. Among the three kinds of CAS, DA had the highest content(1.922×10-19 mol/L·cell), E had the lowest content (0.612×10-19 mol/L·cell), and NE had

6、intermediate (1.452×10-19 mol/L·cell). In the supernatants, NE content was the highest (2.44×10-9 mol/L), DA medium(1.436×10-9 mol/L) and E the lowest (1.14×10-9 mol/L). Conclusion: The improved HPLC method can effectively detect CA levels including NE, E and DA in the cultu

7、red lymphocytes and the cultured supernatants, and it shows that lymphocytes have the ability to synthesize and secrete CAs.       Lymphocyte; Catecholamines; High performance liquid chromatography    機體內(nèi)兒茶酚胺（catecholamines，CAs）包括去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、腎上腺素

8、（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）。近年來 研究 發(fā)現(xiàn)，免疫細胞也能合成CAs，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但關于淋巴細胞合成和分泌CAs的直接證據(jù) 目前 仍未見報道。CAs的測定方法主要有三羥基吲哚法、乙二胺縮合法、放射酶學法、氣相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法及稀土離子熒光探針法等，但存在成本高、步驟繁瑣，靈敏度低等缺點。隨著色譜技術的 發(fā)展 及日趨完善，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）以其靈敏度高、重復性好的優(yōu)點正逐漸取代其它檢測方法，成為臨床上檢測生物樣品中CAs含量最可靠的方法之一。然而，由于淋巴細胞合成

9、和釋放的CAs極微量，本研究對淋巴細胞樣品進行前期預處理，去除干擾因素，然后再采用HPLC經(jīng)AtlantisC18反相色譜柱分離，電化學檢測法檢測，能很好地優(yōu)化檢測條件，取得了滿意的分離檢測效果。    1   材料與方法     1.1   淋巴細胞培養(yǎng)   SD大鼠（SPF級），體重200250 g，雌雄兼用，由南通大學實驗動物中心提供。大鼠行頸椎脫臼法處死，無菌條件下取腸系膜淋巴結，以RPMI-1640基礎培養(yǎng)液洗滌，碾碎，過濾，并以RPMI-1640基礎培養(yǎng)液離心（2

10、00 g，5 min）洗滌3次。以完全培養(yǎng)液將細胞沉淀重懸，混勻。滴于計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為（12）×106個細胞/ml，每ml細胞懸液中加入刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）5 l，置于37、5CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時。    1.2   樣品預處理   取培養(yǎng)48小時后的淋巴細胞懸液，離心（200 g，5 min），將細胞與培養(yǎng)液分離。取分離出的培養(yǎng)液上清，加入等體積的0.5 mol/L的Tris（pH=10）、50 mg氧化鋁（預先在105中烘烤至少3小時）、適量的3,4-二羥基芐胺（dihydroxybenzylamine，DHBA）作為內(nèi)標，輕搖15 min，離心去上清，用超純水洗滌沉淀3遍，再加入0.5 ml 0.5 mol/L的高氯酸，充分振蕩，離心200 g×8 min后取上清，用于HPLC測定。每毫升細胞沉淀中加入150 l的0.1N高氯酸，置于超聲波細胞粉碎儀上對細胞進行破碎，后加入150 l的0.8 N高氯酸，離心（200 g，4，10 min）后取上清，其中加入適量的DHBA，用于HPLC測定。 關鍵詞:檢測,高效,釋放,細胞,合成,淋巴,醫(yī)學論文,淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測 內(nèi)容摘要:本文由中國