異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及安全性-

1、中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志CHINESE JOURNAL OF ALLERGYCLINICAL IMMUNOLOGY·臨床研究·異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及安全性王秦,李小峰#,馬麗輝,李軍霞,陳俊偉,李芳,薛麗巾,白潔(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,太原030002摘要:目的探討異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(uhcMSC移植治療難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA的療效及安全性。方法從足月順產(chǎn)供者臍帶中分離培養(yǎng)MSC,給予3例RA患者行MSCs移植治療,移植細(xì)胞數(shù)(1106/kg體重。評價患者移植前后的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的改變。結(jié)果異基因MSC移植后,3例RA患

2、者隨訪9 11個月,所有患者均無移植相關(guān)并發(fā)癥。移植后1月疾病活動評分(DAS-28由5.13降低為2.16(n=3,1例血液系統(tǒng)受累患者血細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板均上升。移植前后比較抗環(huán)瓜氨酸(CCP抗體滴度降低。1例患者移植前后比較Th17細(xì)胞明顯升高,Treg細(xì)胞降低。結(jié)論異基因臍帶MSC移植治療難治性RA有效、安全。uhcMSC取材方便,擴(kuò)增迅速,輸注安全經(jīng)濟(jì)。關(guān)鍵詞:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;移植中圖分類號:R593.22;R457.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:1673-8705(201103-0202-05Allogenic Derived Mesenchymal St

3、em Cells Transplantationfor4Patients with Rheumatoid ArthritisWANG Qin,LI Xiao-feng#,MA Li-hui,LI Jun-xia,CHEN Jun-wei,LI Fang,XUE Li-jin,BAI Jie(Department of Rheumatology and Immunology,the Second Hospital AffiliatedMedical College of Shanxi University,Taiyuan030002,ChinaObjective To explore the c

4、linical efficacy and safety of allogenic derived mesenchymal stem cells transplantation(MSCTin patients with refractory rheumatoid arthritis(RA.Methods Three patients with refractory RA(all were female patientsaged4347were enrolled in the study and the Ethics Committee of the Affiliated The Shanxi M

5、edical University approved informed consent was obtained for each patient.The umbilical cord of healthy donors were aspirated and the mesenchymal stem cells(MSCwere expanded in vitro.MSC1106/kg body weight was infused intra-venously for each patient.Before MSCT, all patients were administrated with

6、cyclophosphamide(CTX400600mg.The clinical manifestations and laboratory tests were compared before and after MSCT.Results The three patients were followed up for nine to eleven months after MSCT.No patient had developed transplantation related complications.The rheumatoid arthritis disease activity

7、scord(DAS-28score decreased from5.13to2.16one month after MSCT(n=3.Erythrocyte sedimentation rate(ESRdecreased significantly one month after MSCT(n=基金項(xiàng)目:山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009,山西省教育廳創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2010030;#通信作者電話:137*,電子郵件:lixf2003 異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及安全性3.Three patients were followed up for nine months,anti

8、-cyclic citrullinated peptide(anti-CCPantibody titer decreased significantly.One patients had increased whole blood cell counts one month after MSCT. Bone pain disappeared one month after MSCT.In two patients,blood Treg cells fell down mildly and Th17 cell were increased.Conclusion Treating refracto

9、ry RA with allogenic MSCT is effective and safe. However,further observation is required to evaluate long term efficacy.Key words:mesenchymal stem cells;rheumatoid arthritis;transplantationChin J Allergy Clin Immunol,2011,5(3:202-206類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA是一種高度致殘性自身免疫性疾病,臨床特征為對稱性多關(guān)節(jié)炎,病理改變?yōu)榛ぱ?/p>

10、、軟骨及骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。在我國RA的發(fā)病率約為0.34%,患病總?cè)藬?shù)達(dá)500萬,每年直接用于RA的治療費(fèi)用和因勞動力喪失帶來的間接經(jīng)濟(jì)損失很大。目前國際公認(rèn)的RA最佳治療策略是早期聯(lián)合使用改善病情的抗風(fēng)濕藥物,這些聯(lián)合方案使RA患者的致殘率有所下降,但其臨床緩解率僅能達(dá)到40% 70%1。近年的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用,這為調(diào)節(jié)RA患者機(jī)體免疫紊亂,以及修復(fù)受損關(guān)節(jié)帶來了新的希望2。本研究在用異基因臍帶MSC移植治療膠原關(guān)節(jié)炎大鼠(CIA有效的基礎(chǔ)上,嘗試用異基因MSC移植治療RA。目前已完成3例難治性RA患者治療

11、,取得較好療效。資料和方法病例選擇2010年2月至2010年4月于本院就診的RA患者3例,診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)院(ACR1997年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。3例患者均為女性,年齡43 47歲,病程3月 20年。疾病活動評分(DSA-2811.75.1,其中1例存在雙側(cè)股骨頭壞死, 1例患者血液系統(tǒng)受累合并重度血小板減少,臨床資料見表1。本研究程序符合本單位倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并得到該委員會批準(zhǔn),取得所有患者的知情同意。MSC移植適應(yīng)證及禁忌證MSC移植主要用于難治性結(jié)締組織病(connec-tive tissue disease,CTD,常規(guī)激素、免疫抑制劑控制欠佳如狼瘡性腎炎、肺動脈高

12、壓、重度血細(xì)胞減少,表1MSC移植前患者基本資料Table1Basic information of patientsbefore MSCs translations病例年齡(歲病程(月移植前DAS-28移植前用藥145290 5.13MTX10mg/周,CTX0.2g/3周,英利昔單抗0.1g3次2473 6.14P60mg/d,CTX0.2g/3周,VCR1mg3次,LEF10mg/d 34386 3.65MMF0.5g/dDAS-28:疾病活動評分;P:強(qiáng)的松;MTX:甲氨蝶呤;CTX:環(huán)磷酰胺;MMF:嗎替麥考酚酯;VCR:長春新堿;LEF:來氟米特終末期器官功能衰竭患者除外。納入標(biāo)準(zhǔn)

13、:符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ARA修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn),年齡16 65歲;排除標(biāo)準(zhǔn):晚期畸形殘廢、喪失勞動力者;女性妊娠者不作驗(yàn)證;不符合納入標(biāo)準(zhǔn),未按規(guī)定用藥,無法判斷療效或資料不全等影響療效或安全性判斷者;不愿簽署進(jìn)入臨床研究知情同意書者。移植方法對3例患者行異基因臍帶MSC移植。異基因臍帶MSC來源:MSC由深圳北科生物有限公司提供,采集、分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)步驟如下:取足月順產(chǎn)、無并發(fā)癥的新生兒臍帶,生理鹽水沖洗,切割至乳糜狀,接種于75cm2培養(yǎng)瓶中,每瓶含20ml低糖細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbeccos modified eagle medium,DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,置3

14、7、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 48h后換液,去掉非貼壁細(xì)胞,之后每3d以低糖DMEM完全培養(yǎng)液換液1次。培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化,按13的比例傳代,擴(kuò)增后的中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志MSC計(jì)數(shù)并鑒定,加入5%人體白蛋白溶液中靜脈回輸。低糖DMEM、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購自美國BD公司。移植方案:移植前予CTX0.4 0.6g,靜脈輸注,輸注后予MSC移植,每周輸注1次,連續(xù)4周,移植細(xì)胞數(shù)為1106/kg體重。移植前MSC用0.25%胰蛋白酶消化,反復(fù)洗滌后加入5%人體白蛋白溶液中靜脈回輸。移植前給予地塞米松5mg預(yù)防過敏反應(yīng)。療效評價:移植后隨

15、訪時間為9 11個月,對移植前后患者臨床表現(xiàn)改善情況和實(shí)驗(yàn)室檢查如血清類風(fēng)濕因子(RF、抗環(huán)瓜氨酸抗體(a-CCP、抗核周因子(APF,抗角蛋白抗體(AKA,免疫功能、T 細(xì)胞亞群等指標(biāo)進(jìn)行比較以及移植相關(guān)并發(fā)癥等方面進(jìn)行評價。移植后維持治療所有患者均采用移植前原方案維持治療(移植前原方案無效。觀察1周后免疫抑制劑逐漸減量。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs表示,常規(guī)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA,以LSD法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)方差不齊時,采用DunnettT3進(jìn)行兩兩比較。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),制圖。P0.05為差異有統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)意義結(jié)果MSC移植后的隨訪與評價所有移植患者輸注異基因MSC時均無并發(fā)癥。病例1,女43歲,1986年出現(xiàn)雙肩關(guān)節(jié)疼痛,后逐漸延及雙膝關(guān)節(jié)、伴雙手小關(guān)節(jié)疼痛,一直以中藥治療效果不佳。1995年開始出現(xiàn)雙手掌指關(guān)節(jié)、近端指間關(guān)節(jié)腫脹畸形,晨僵時間1h,仍以中醫(yī)中藥治療,關(guān)節(jié)反復(fù)腫痛,開始出現(xiàn)乏力、頭暈。2004年因癥狀加重就診當(dāng)?shù)蒯t(yī)院,化驗(yàn)RF陽性,血紅蛋白43g/L,診斷為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重度營養(yǎng)不良性貧血。給予潑尼松40mg,每日1次口服;甲氨蝶呤(MTX10mg,每周1次口服,癥狀緩解。出院后服用上述2種藥物4年,因恐懼藥物毒性,自覺癥狀緩解逐漸減停。停藥后2周于2008年4月底再次出現(xiàn)

17、多關(guān)節(jié)腫痛,并持續(xù)加重,不能行走,當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為雙側(cè)股骨頭壞死,一直服用中草藥治療,療效差。2009年12月病情再次加重,就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予以注射人鼠嵌合腫瘤壞死因子單抗(Infliximab IFX,商品名:類克200mg,治療3次,聯(lián)合MTX15 mg,每周1次,癥狀無明顯緩解。為進(jìn)一步診治入住我科。入院后患者臥床,雙手雙足關(guān)節(jié)畸形,雙側(cè)股骨頭疼痛明顯,以靜息痛為主,影響睡眠,DAS-28評分為5.13。在獲得患者知情同意后行異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC移植治療。移植前用藥見表1,細(xì)胞移植2次后,患者雙側(cè)股骨頭靜息痛明顯減輕,睡眠質(zhì)量明顯改善;治療4周后,病情緩解明顯,2、3、4周紅

18、細(xì)胞沉降率(ESR分別為53mm/h、50mm/h、43mm/h,DAS-28評分分別為5.13、4.75、4.24,雙側(cè)股骨頭靜息痛消失,左膝關(guān)節(jié)、左髖區(qū)、雙踝關(guān)節(jié)疼痛明顯減輕,可拄杖行走,雙手伸直度較前改善。D-二聚體(D-Dimer由1019降為509,治療藥物減量為MTX10mg,每周1次;CTX 0.2g,每3周1次,出院后繼續(xù)免疫抑制劑治療。移植3月后復(fù)查血清自身抗體滴度明顯減低,免疫功能提示B細(xì)胞總數(shù)減少,Ts細(xì)胞稍升高(表2、3。移植后6個月,一般情況良好,MTX7.5mg口服,每周1次,CTX0.2g,每3周1次。病例2,女47歲,因?qū)ΨQ性多關(guān)節(jié)腫痛3月,加重20d入住我院。

19、患者2009年底出現(xiàn)對稱性小關(guān)節(jié)腫痛,累及雙手、雙足小關(guān)節(jié)。伴晨僵約30min,未在意,入院前2周關(guān)節(jié)癥狀加重。就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查RF增高,伴重度血小板(PLT減少,為進(jìn)一步診治入住我科。入院后查PLT36109/L;化驗(yàn)給予醋酸潑尼松60mg/d,口服,靜脈用丙種球蛋白22.5g,連用5d,來氟米特(LEF10mg/d、長春新堿1mg,每周1次,并輸注單采PLT1U,CTX 200mg/3周。PLT恢復(fù)不理想,最低至17109/L,給予間充質(zhì)干細(xì)胞治療2次后,患者一般狀況明顯改善,ESR從62mm/h降為22mm/h,DAS評分由6.14降為2.14,PLT水平恢復(fù)正常,血清抗體水平及免疫功能

20、在移植后3個月復(fù)查明顯改善(表2、3。尤其是Th亞群的檢測,可以看到該患者移植前及移植后3個月Th1/Th2比值下降,Th17細(xì)胞從2.14降為0.06,Treg細(xì)胞升高至1.5。移植后6個月、9個月復(fù)查,病情平穩(wěn),目前激素及免疫抑制異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及安全性劑減量中。病例3,女45歲,因雙手關(guān)節(jié)反復(fù)腫痛7年,化驗(yàn)RF800IU/ml、抗CCP200RU/ml,診斷為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。予口服非甾體消炎藥、白芍總甙及LEF等藥物,癥狀緩解,但出現(xiàn)肝酶升高,膽紅素升高。因患者對免疫抑制劑的治療不能耐受,經(jīng)患者同意后行間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療。治療4周后患者自覺癥狀明顯改善,移植

21、后3個月血清抗體較移植前明顯降低(表2。但移植后6個月患者再次出現(xiàn)左手掌指關(guān)節(jié)腫痛,抗體水平再次升高,加用LEF等藥,又出現(xiàn)肝功能異常。目前換用重組人腫瘤壞死因子受體融合蛋白(商品名為益賽普治療,一般情況尚可。表2移植前后患者血清抗體滴度比較Table2Serum antibody titers compared beforeand after transplantation血清抗體病例1病例2病例3移植前移植后3月移植前移植后3月移植前移植后3月RF(RU/ml320801604032040a-CCP(RU/ml587.6102.61600318.6569.598.5 ANA1640H180

22、1160S120(-(- AKA(-(-120(-(-(- APF120(-180(-(-(- RF:類風(fēng)濕因子;a-CCP:抗環(huán)瓜氨酸抗體;ANA:抗核抗體;AKA:抗角蛋白抗體;APF:抗核周因子表3移植前后患者血清免疫功能的變化Table3Serum changes of immune function before and after transplantation細(xì)胞表型病例1病例2移植前移植后3月移植前移植后3月百分?jǐn)?shù)絕對值百分?jǐn)?shù)絕對值百分?jǐn)?shù)絕對值百分?jǐn)?shù)絕對值CD34+CD19-66605601895471433861850 CD34-CD19+212001262846137859

23、0 CD3+CD4+342932730825784601405 CD3+CD8+2420631346185702580討論MSC是存在于骨髓中的一類干細(xì)胞,能分化為分泌多種細(xì)胞因子、黏附分子的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,支持造血和調(diào)節(jié)免疫功能且無免疫原性。體內(nèi)、外研究均表明MSC具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)作用、抑制T 細(xì)胞增殖、治療移植物抗宿主病(GVHD等。瑞典斯德哥爾摩Huddinge大學(xué)醫(yī)院臨床免疫/干細(xì)胞移植中心和血液科聯(lián)合,于2003年首次將異基因骨髓MSC移植用于人GVHD的治療3。本研究進(jìn)一步研究了RA患者骨髓MSCs的生物學(xué)特性及分化功能,前期研究發(fā)現(xiàn)RA-MSC存在異常表現(xiàn):1RA患者骨髓

24、MSC體外生長較正常人緩慢,存在早衰,不能長期傳代;2RA患者M(jìn)SC分泌細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6、IL-17減低;3MSC 移植治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA大鼠,發(fā)現(xiàn)MSC使Th1/Th2平衡向Th2偏移。推測MSC的異?？赡茉赗A的發(fā)病中起重要作用,而MSC缺陷為原發(fā)性而非繼發(fā)性。前期對CIA模型及RA的研究中,我們還觀察到RA患者體內(nèi)存在T細(xì)胞亞群紊亂,存在Th17的高表達(dá)4。前期的動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MSC移植治療膠原關(guān)節(jié)炎大鼠均無并發(fā)癥,關(guān)節(jié)炎評分及關(guān)節(jié)病理有明顯改善,檢測T細(xì)胞亞群Th17及Treg均提示有免疫調(diào)控作用,其療

25、效肯定。進(jìn)一步提示MSCs能調(diào)節(jié)RA患者機(jī)體免疫紊亂,阻止病情進(jìn)展5。因此,推測MSC移植治療RA 患者有效,而且提出RA患者自體MSC移植不合適,應(yīng)選擇異體(異基因MSC移植的觀點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上本研究治療難治性RA患者3例,行異體臍帶MSC 移植。移植后觀察MSCs能顯著改善病情,降低DAS-28評分,減少免疫抑制劑的用量。在對T淋巴細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn),移植前后有一定的變化,其中病例2患者觀察到Th17/Treg的比值由移植前的391降到移植中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志后(3個月的125,變化較明顯,提示患者體內(nèi)T 細(xì)胞亞群在疾病的發(fā)生發(fā)展中可能有一定的作用,尤其是Th17/Treg的平衡,但因病例數(shù)尚少,還需繼續(xù)觀察。本研究目前為止未見明顯不良反應(yīng)的發(fā)生,提示異體(異基因MSC移植是安全的。異體臍帶M