SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

1、 SDSSDSPAGEPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì) 相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。 掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。 運(yùn)用運(yùn)用SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。定。帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象現(xiàn)象。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，分子在凝膠介質(zhì)中的遷移速率取決。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，分子在凝膠介質(zhì)中的遷移速率取決于分子的大小、構(gòu)型和帶電量的大小。于分子的大小、構(gòu)型和帶電量的大小。 聚

2、丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（PAGPAG）是由）是由丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)在在四甲基乙二胺四甲基乙二胺 TEMEDTEMED 和和過(guò)過(guò)硫酸銨硫酸銨(AP) (AP) 的作用下的作用下。以此以此凝膠作為支持介質(zhì)的電泳稱為凝膠作為支持介質(zhì)的電泳稱為。 具有電泳和分子篩的雙具有電泳和分子篩的雙重作用。重作用。 CH2=CHC=ONH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CHCH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH

3、2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )mPAGPAG機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。緩沖液緩沖液pHpH值與凝膠中的相同值與凝膠中的相同. .帶電顆粒在電場(chǎng)帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要作用下，主要。帶電帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。佳。 SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加

4、入是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDSSDS和含有巰基乙醇的和含有巰基乙醇的樣品處理液，樣品處理液，是一種很強(qiáng)的是一種很強(qiáng)的，它，它可以可以，破壞蛋白質(zhì)分子的二，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)?？梢钥梢云茐牡鞍踪|(zhì)的四級(jí)破壞蛋白質(zhì)的四級(jí) 結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解 聚后的側(cè)鏈與聚后的側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的 蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈

5、電荷的差異。帶凈電荷的差異。而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。 將已知分子量的將已知分子量的在在 中的電泳遷中的電泳遷移率移率，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,00017,000165,000165,000之間時(shí)，之間時(shí)， 的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：數(shù)呈線性關(guān)系： 用海綿和洗滌劑輕柔地清洗，嚴(yán)禁使用刷子和顆粒狀的

6、用海綿和洗滌劑輕柔地清洗，嚴(yán)禁使用刷子和顆粒狀的去污粉與洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干。去污粉與洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干。 配制配制12%12%分離膠。在燒杯中依次加入分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水重蒸水3.35ml,3.35ml,分離膠緩沖液分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.81.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS 0.1ml,2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝膠儲(chǔ)備液凝膠儲(chǔ)備液4.0ml4.0ml，10% 10% 過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨50ul50ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEM

7、ED相遇后凝膠相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長(zhǎng)、即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，留出梳齒的齒高加短玻璃板間的窄縫內(nèi)，留出梳齒的齒高加1cm1cm的空間停止灌膠，小心的空間停止灌膠，小心覆蓋一層蒸餾水，覆蓋一層蒸餾水，3737烘箱下聚合（約烘箱下聚合（約30 min30 min）。待分離膠聚合完全）。待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的蒸餾水。后，除去覆蓋的蒸餾水。 配制配制5%5%濃縮膠。在燒杯中依次加入濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水重蒸水2.92ml,2.92ml,濃縮膠濃縮膠緩沖液緩沖液(0.5mol/L Tri

8、s-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝膠儲(chǔ)備液凝膠儲(chǔ)備液0.8ml0.8ml，10% 10% 過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨25ul25ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEMED相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，灌滿后小心移液槍抽取凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，灌滿后小心插入梳齒，避免混入氣泡，插入梳齒，避免混入氣泡，3737

9、烘箱下聚合（約烘箱下聚合（約30 min30 min）。）。 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒: :兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 開封后，沸水浴中加熱開封后，沸水浴中加熱3-5min3-5min后上樣。后上樣。 用移液槍小心吸取處理好的血清用移液槍小心吸取處理好的血清50ul50ul至至1.

10、5ml1.5ml的離心管中，再加入的離心管中，再加入50ul50ul上樣緩沖液，混勻后上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱沸水浴中加熱3min3min，取出冷卻后加樣。，取出冷卻后加樣。 將電泳儀的正負(fù)極與電泳槽正負(fù)極相連接，將電泳儀的正負(fù)極與電泳槽正負(fù)極相連接，打開電泳儀開關(guān)，設(shè)置電壓為打開電泳儀開關(guān)，設(shè)置電壓為200V200V，電泳電泳60mins,60mins,此時(shí)溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部，停止電此時(shí)溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部，停止電泳，關(guān)閉電源。泳，關(guān)閉電源。 用移液器分別取用移液器分別取5 l l樣品液，小心將樣品加樣品液，小心將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。到凝膠凹形樣品槽底部。 量出加樣端距細(xì)

11、銅絲間的距離量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離(cm)(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率m mR R： 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率m mR R= =蛋白質(zhì)樣品遷移距離蛋白質(zhì)樣品遷移距離(cm)(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離(cm)(cm)電泳結(jié)束后，取下玻板，在自來(lái)水下用特制板撬開電泳結(jié)束后，取下玻板，在自來(lái)水下用特制板撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入染色液染色染色液染色60 mins60 mins，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。1、在上樣緩沖液中在上樣緩沖液中SDS