電噴霧離子化多級質(zhì)譜解析環(huán)孢菌素結(jié)構(gòu)

1、電噴霧離子化多級質(zhì)譜解析環(huán)孢菌素結(jié)構(gòu)(1)        作者：陳振偉 溫耀明 季新燕 鄭衛(wèi) 【摘要】 應用電噴霧離子化多級質(zhì)譜法分析四種環(huán)孢菌素同系物，并對它們的裂解規(guī)律進行分析歸納。在電噴霧離子化多級質(zhì)譜條件下，環(huán)孢菌素先形成N端加質(zhì)子的M H 分子離子，然后沿肽鏈的酰胺鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生相應的碎片離子，開環(huán)裂解主要發(fā)生在2和3位、1和11位以及5位和6位氨基酸殘基之間。這一裂解規(guī)律可應用于環(huán)孢菌素類化合物的快速結(jié)構(gòu)鑒定。 【關鍵詞】 電噴霧離子化 多級質(zhì)譜 環(huán)孢菌素 結(jié)構(gòu)鑒定   

2、 Structural characterization of cyclosporins by    electrospray ionization mass spectrometry    ABSTRACT Electrospray ionization mass spectrometry method was applied to the structural characterization of cyclosporins, the fragmentation patterns and struct

3、ural assignments of cyclosporins were discussed. Under the experimental conditions, cyclosporins first form M H ion by absorbing a proton on the N atom, then the amide bond split and a series of fragments formed. The main fragmentation pathways started by primary splitting between amino acid residue

4、s 23,111 and 56. The corresponding Nterminal btype ions were common fragment types in the mass spectra. The fragmentation scheme could be used for rapid amino acid sequence determination of cyclosporins.    KEY WORDS Electrospray ionization;Mass spectrometry;Cyclosporins;Structur

5、al characterization    環(huán)孢菌素是由真菌產(chǎn)生的一組環(huán)狀十一肽物質(zhì)，其中環(huán)孢菌素A(CsA，F(xiàn)ig.1)已作為重要的免疫抑制劑廣泛應用于器官移植時的抗排斥反應，此外，環(huán)孢菌素還具有多種其它重要的生物活性如免疫抑制、抗真菌、抗寄生蟲、抗炎、抗HIV、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥、治療I型糖尿病、瘧疾、牛皮癬等作用13。目前已從其最初的產(chǎn)生菌雪白白僵菌(Beauveria bassiana)的代謝物中分離到了二十多個環(huán)孢菌素同系物，并在多達17種真菌的代謝產(chǎn)物中分離到各種環(huán)孢菌素類化合物1，4，5。篩選具有各種生物活性的新環(huán)孢菌素同系物已成為當今

6、環(huán)孢菌素研發(fā)的一個熱點，天然和半合成的環(huán)孢菌素類化合物已超過800個，因此建立一種可以快速鑒別環(huán)孢菌素化學組成的方法顯得尤為重要。    由于環(huán)孢菌素類化合物為兩端封閉的環(huán)狀十一肽物質(zhì)，不能直接用Edman降解法對其十一個氨基酸進行序列分析，因此，早期環(huán)孢菌素類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定多采用NMR、IR和MS以及x射線晶體衍射等方法進行，并結(jié)合強酸水解后測定分子中氨基酸含量的方法最終確定環(huán)狀十一肽的序列，方法復雜繁瑣6，7。    自20世紀80年代以來生物質(zhì)譜技術在蛋白質(zhì)和多肽結(jié)構(gòu)鑒定中的應用日趨成熟，對肽鍵斷裂過程的研

7、究表明肽鍵的斷裂主要有b和y兩種模式，在b模式中，電荷從N 轉(zhuǎn)移到O 上，離子生成在斷裂肽鍵的C端，形成b離子；在y模式中，電荷不轉(zhuǎn)移，發(fā)生氫重排，離子生成在斷裂肽鍵的N端，形成y離子，如Fig.2所示。因此，可以利用質(zhì)譜技術對短肽進行氨基Cs: A X=H, Y=CH3; B: X=Y=H; C: X=OH, Y=CH3; D: X=Y=CH3; H (DMeVal11) CsA    1993年Vladimír等報道了用快原子轟擊(FAB)結(jié)合碰撞活化解離(collisionally activated dissociation，CAD)質(zhì)

8、譜方法分析環(huán)孢菌素的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在快原子轟擊質(zhì)譜中先由一個質(zhì)子加到環(huán)孢菌素的某個氨基氮上，形成M H 離子，然后沿肽鏈的酰胺鍵(如1和11位氨基酸之間的酰胺鍵)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生一系列短肽片段離子(即b離子)。對環(huán)孢菌素而言，最容易發(fā)生斷裂的位置為1和11位氨基酸之間(b111)，2和3位氨基酸之間(b23)以及5和6位氨基酸之間(b56)，以環(huán)孢菌素A為例，其2和3位氨基酸之間酰胺鍵斷裂的方式如Fig.3所示9。    FAB結(jié)合CAD質(zhì)譜方法能直接判斷環(huán)孢菌素中十一個氨基酸的序列和組成，為環(huán)孢菌素類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了一個快捷準確的分析方法。但是，

9、FAB質(zhì)譜方法還存在一些局限性，如分析過程中需要加入基質(zhì)；由于采用單一高能量的轟擊源(6kV)，會產(chǎn)生許多非選擇性，無規(guī)律的碎片離子峰，因此無法進行多級質(zhì)譜(MSn)分析。    20世紀80年代發(fā)展起來的電噴霧離子化(ESI)質(zhì)譜目前已在天然產(chǎn)物的分子量測定和結(jié)構(gòu)解析中得到廣泛應用10，其離子化方法屬于“軟離子化”源，樣品分子靠帶電液滴產(chǎn)生的庫侖排斥力進入氣相，不受外部能量激發(fā)，因此樣品分子一般不發(fā)生裂解，在一級質(zhì)譜圖上主要得到分子離子峰，再結(jié)合離子阱等技術進行多級質(zhì)譜分析，將選定的離子加速至合適的動能，通過碰撞誘導解離技術(CID)得到一系列碎片離子

10、。對化合物的碎片離子進行分析歸納，從中得出化合物的裂解規(guī)律。本文報道應用電噴霧離子化(ESI)多級質(zhì)譜分析環(huán)孢菌素中氨基酸序列的工作。    1 材料和方法    1.1 實驗材料    環(huán)孢菌素標準品(CsA、CsB、CsC、CsD)均為粉末，由福建省微生物研究所提供，它們的氨基酸組成和分子量見Tab.1；甲醇、色譜純?yōu)镸erck公司生產(chǎn)；甲酸和分析純?yōu)橹袊?lián)試化工試劑有限公司產(chǎn)品。       

11、0;1.2 實驗儀器    美國Agilent公司1100SL型離子阱質(zhì)譜儀(MSD Trap)。    1.3 實驗方法    (1)樣品制備 將適量CsA、CsB、CsC、CsD標準品分別溶解于含有0.1%甲酸的甲醇溶劑中，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?#160;   (2)多級質(zhì)譜條件 采用直接進樣法對樣品進行電噴霧電離多級質(zhì)譜分析。電噴霧離子化源(ESI源)；極性檢出模式為正模式(MS )；毛細管電壓4000V；干燥氣(N2)流速5.98L/min

12、；干燥氣溫度300；霧化氣壓力20.00psi；裂解器電壓1.11.5V；最大積聚時Fig.3    Cleavages between amino acid residues 23 in CsA under FAB/CAD conditions    間300ms；目標(ICC Target)30000；全程掃描時間23min；掃描范圍：501400m/z。    2 結(jié)果與分析    2.1 實驗結(jié)果  

13、0; 在實驗條件下，對質(zhì)荷比范圍501400的離子進行多級掃描，獲得樣品三級質(zhì)譜圖(以CsB為代表，F(xiàn)ig.47)。在一級質(zhì)譜圖中主要得到CsB的M H 分子離子，在二級和三級質(zhì)譜圖中主要得到M H 分子離子經(jīng)碰撞誘導解離技術(CID)得到的一系列b型碎片離子，質(zhì)譜圖中觀察到的主要碎片離子分別歸納列于Tab.24。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。    2.2 分析與討論 

14、60;  (1)環(huán)孢菌素在電噴霧離子化質(zhì)譜中的裂解規(guī)律與在FAB中的相同，即主要產(chǎn)生b型碎片離子，由于采用低能量的離子化源，與FAB/CAD方法比較，可以應用電噴霧離子化多級MS/MS技術得到更多的有規(guī)律裂解的碎片離子，如對b56碎片離子而言，在電噴霧離子化多級質(zhì)譜中可以檢測出一系列的碎片離子(Tab.4)，而在FAB/CAD質(zhì)譜中只檢測出b656、b556和b456。因此，應用電噴霧離子化多級質(zhì)譜分析環(huán)孢菌素，能得到更多的氨基酸序列信息。    (2)環(huán)孢菌素是由11個氨基酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，故理論上有11種不同的裂解方法。但通過對質(zhì)

15、譜圖的分析發(fā)現(xiàn)2位和3位間、1位和11位間、5位和6位間的裂解是主要的裂解方式，質(zhì)譜圖中觀察到的大部分碎片離子峰都是由這3種裂解方式通過有次序的脫去氨基酸所產(chǎn)生的(Fig.26，Tab.24)。由于不同的裂解方式產(chǎn)生的碎片離子不盡相同，因此可以根據(jù)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的碎片離子峰推導出環(huán)孢菌素的氨基酸序列。    (3)對分子中存在羥基的環(huán)孢菌素，F(xiàn)AB/CAD質(zhì)譜中出現(xiàn)MHOH 峰，而在電噴霧離子化多級質(zhì)譜中只出現(xiàn)MHH2O 峰，因此很容易根據(jù)脫水峰的碎片離子判斷化合物中羥基的數(shù)目，如環(huán)孢菌素C含兩個羥基，在質(zhì)譜圖中出現(xiàn)很明顯的兩個脫水后的碎片離子峰(Tab.

16、24)。    (4)根據(jù)電噴霧離子化多級質(zhì)譜中的MHH2O 峰可以進一步分析確定環(huán)孢菌素中的氨基酸序列，以環(huán)孢菌素A為例，如開環(huán)裂解方式為b111(1位和11位間開環(huán)裂解)時，因1位上含羥基的特殊氨基酸MeBmt位于鏈狀結(jié)構(gòu)的末端(Fig.8)，所以此途徑產(chǎn)生的碎片離子均含有MeBmt，也就可以形成相應的bn111H2O 。b23開環(huán)裂解方式(Fig.3)中，b923以下均不含MeBmt，因此不產(chǎn)生相應的bn23H2O 。同理，b56開環(huán)裂解方式(Fig.8)中，b656以下不產(chǎn)生相應的bn23H2O 。因此根據(jù)碎片離子的脫水情況可以基本確定含羥氨基酸基所在的位置。    (5)在FAB質(zhì)譜分析中，Vladimír等根據(jù)圖譜中出現(xiàn)MH113 離子峰的情況推測這可能是1位上特殊氨基酸MeBmt側(cè)鏈發(fā)生裂解后產(chǎn)生的離子峰MHC7H13O ，也可能歸屬于b11011MHMeVal 或其它裂解方式產(chǎn)生的碎片離子峰，在本實驗中，根據(jù)3種斷