動物胚胎工程復(fù)習(xí)資料2

1、補充內(nèi)容：一動物細胞培養(yǎng)（animal cell culture）就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞（使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。動物細胞培養(yǎng)的條件1.無菌、無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防止細胞代謝產(chǎn)物累積對細胞自身產(chǎn)生危害。2.營養(yǎng)物質(zhì)：無機物（無機鹽、微量元素等），有機物（糖、氨基酸、促生長因子等）3.血清和血漿 (提供細胞生長必須的營養(yǎng)成份)4.溫度和pH（36.5±0.5，7.27.4）5.氣體環(huán)境（95%

2、的空氣+5%CO 2的混合氣體）其中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定體外細胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)基本相同，例如，需要糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素等。將細胞所需的上述物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。由于動物細胞生活的內(nèi)環(huán)境還有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入動物血清以提供一個類似生物體內(nèi)的環(huán)境，因此在使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入血清、血漿等一些天然成分?；具^程取動物胚胎或幼齡動物器官、組織。將材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用膠原蛋白酶）處理（消化），形成分散的單個細胞，將處理后的細胞移入培養(yǎng)基中配成一定濃度的細胞懸浮液。懸液中分散的細胞很快就貼附在

3、瓶壁上，成為細胞貼壁。當貼壁細胞分裂生長到互相接觸時，細胞就會停止分裂增殖，出現(xiàn)接觸抑制。此時需要將出現(xiàn)接觸抑制的細胞重新使用胰蛋白酶處理。再配成一定濃度的細胞懸浮液。另外，原代培養(yǎng)就是從機體取出后立即進行的細胞、組織培養(yǎng)。當細胞從動植物中生長遷移出來，形成生長暈并增大以后，科學(xué)家接著進行傳代培養(yǎng)，即將原代培養(yǎng)細胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長、增殖。通過一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細胞稱為細胞株。當培養(yǎng)超過50代時，大多數(shù)的細胞已經(jīng)衰老死亡，但仍有部分細胞發(fā)生了遺傳物質(zhì)的改變出現(xiàn)了無限傳代的特性，即癌變。此時的細胞被稱為細胞系。方法消化法

4、消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡23秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hanks液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hanks液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消化2040分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。5

5、、加入35ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6、靜置510分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。8、加入Hanks液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。9、加入培養(yǎng)液l2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。10、將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37下培養(yǎng)。組織塊法 自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。于37靜置35小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37繼續(xù)培養(yǎng)。分類根據(jù)細胞種類：原代細胞

6、培養(yǎng)， 傳代細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)中的細胞傳代培養(yǎng)（subculture），當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。

7、這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。原代細胞：將動物各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA) 或機械方法處理，分散成單細胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞為正常的動物細胞，一般培養(yǎng)3-5代后不再增殖，死亡。傳代細胞：傳代培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是所有細胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長，這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量供實驗所需細胞。細胞傳代要在嚴格的無菌條

8、件下進行，每一步都需要認真仔細地?zé)o菌操作。培養(yǎng)的細胞為癌變或人為癌化的細胞，理論上可以無限增殖。癌化的方式有很多：進行癌基因突變，感染病毒，從癌癥供體體內(nèi)分離，物理或化學(xué)方法（如紫外，化學(xué)試劑）等。2 根據(jù)培養(yǎng)方式：貼壁細胞培養(yǎng)，半懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應(yīng)用越來越廣泛。方法：ppt二胚胎發(fā)育精子發(fā)生血睪屏障是動物睪丸中血管和精細管之間的物理屏障。 一屏障是由精細

9、管支持細胞塞爾托利氏細胞（Sertoli Cell）之間的緊密連接形成。它為精原細胞提供營養(yǎng)。血睪屏障防止細胞毒性物質(zhì)（對細胞有毒的個體或物質(zhì)）進入精細管。作用：形成免疫屏障。因為精子是一種抗原，血睪屏障能夠阻擋精子的抗原性，不讓身體產(chǎn)生抗精子的抗體，避免發(fā)生自身免疫反應(yīng)。 防止有害物質(zhì)干擾精子發(fā)生和損害已形成的精子。 為精子產(chǎn)生創(chuàng)造良好環(huán)境，保證精子發(fā)生有一個正常的微環(huán)境。 睪丸的支持細胞是血睪屏障組成的一個重要結(jié)構(gòu)，睪丸的支持細胞，分布在各期生精細胞之間，呈錐體形，底部較寬，貼附于基膜，頂部狹窄，伸入管腔。細胞頂部和側(cè)壁形成許多凹陷，其中鑲嵌著生精細胞。細胞核呈不規(guī)則形，染色淺，核仁明顯。

10、相鄰的支持細胞基部側(cè)突相接，兩側(cè)細胞膜形成緊密連接。此連接位于精原細胞上方，可阻擋間質(zhì)內(nèi)的一些大分子物質(zhì)穿過曲細精管上皮細胞之間的間隙進入管腔，因而起到屏障作用。全部精子發(fā)生過程可以被分為 3 個過程：精原細胞位于生精上皮的基底部，分為 A 、 B 兩種類型。 A 型精原細胞進一步分為 Ad 型和 Ap 型精原細胞。在正常情況下， Ad 型精原細胞不發(fā)生任何有絲分裂，應(yīng)該被視為精子發(fā)生的精原干細胞； Ap 型精原細胞則通常分化增殖為兩個 B 型精原細胞。 B 型精原細胞分裂增殖為初級精母細胞，隨后，初級精母細胞開始 DNA 合成過程。精母細胞經(jīng)歷了減數(shù)分裂的不同階段。粗線期時 RNA 的合成十

11、分活躍。減數(shù)分裂的結(jié)果產(chǎn)生單倍體生精細胞，又稱精子細胞。在精子生發(fā)過程中，減數(shù)分裂是一個非常關(guān)鍵的過程，在這個階段，遺傳物質(zhì)相互重組、染色體數(shù)目減少并最終形成精子細胞。次級精母細胞產(chǎn)生于第一次減數(shù)分裂后。這些生精細胞含有雙份單倍體染色體。在第二次減數(shù)分裂精母細胞演變?yōu)閱伪扼w的精子細胞。第一次減數(shù)分裂前期大概持續(xù) 1 3 周，而除此之外的第一次減數(shù)分裂的其他階段和第二次減數(shù)分裂在 1 2 天之內(nèi)完成。第二次減數(shù)分裂后形成精子細胞，是沒有減數(shù)分裂活性的圓形細胞。圓形的精子細胞經(jīng)過復(fù)雜的顯著變化轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌L度的精子細胞和精子。在第二次減數(shù)分裂中，細胞核發(fā)生的聚縮和塑性，同時鞭毛形成和胞漿明顯擴張。全

12、部精子細胞變形的過程稱為精子形成。卵子發(fā)生卵子發(fā)生(oogenesis)從胚胎發(fā)育早期開始，經(jīng)過胚胎期、出生、直至性成熟才完成。具體變化為，由原始生殖細胞形成到卵原細胞(oogonia)，再由卵原細胞形成成熟卵細胞的過程。變化過程1原始生殖細胞的起源與遷移原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）在胚盤原條尾端部形成，后到達內(nèi)胚層，隨后以阿米巴樣運動遷移到胚胎兩側(cè)的生殖脊上皮內(nèi)。遷移過程中PGCs不斷分裂增殖。2卵原細胞的形成PGCs進一步遷移到未分化性腺的原始皮質(zhì)中，與其他生殖上皮細胞一起形成原始性索。之后PGCs發(fā)生形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)化為卵原細胞，并進入卵原細胞的增殖期

13、(proliferation phase)，在該期，卵原細胞通過有絲分裂增加細胞數(shù)量。3初級卵母細胞的形成和原始卵泡發(fā)生卵原細胞增殖到一定時期，有些細胞開始進入第一次減數(shù)分裂的細線期成為初級卵母細。初級卵母細胞從細線期經(jīng)偶線期、粗線期、雙線期到達核網(wǎng)期后細胞分裂周期被打斷，此時卵母細胞的核較大，成為生發(fā)泡（germinal vesicle），并處于靜止狀態(tài)。此時卵母細胞周圍包有一層扁平的前顆粒細胞，形成原始卵泡，并由他們形成初級卵泡。此后卵泡進入生長和發(fā)育階段，而卵母細胞在卵泡內(nèi)生長發(fā)育直至成熟排卵。受精：精子與卵細胞融合成為受精卵的過程，叫做受精作用。在受精作用進行時，通常是精子的頭部進入卵

14、細胞。尾部留在外面。緊接著，在卵細胞細胞膜的外面出現(xiàn)一層特殊的膜，以阻止其他精子再進入。精子的頭部進入卵細胞后不久，里面的細胞核就與卵細胞的細胞核相遇，使彼此的染色體會合在一起。這樣，受精卵中的染色體數(shù)目又回復(fù)到體細胞中的數(shù)目，其中有一半的染色體來自精子（父方），另一半來自卵細胞（母方）。受精過程大致是：次級卵母細胞需發(fā)育至減數(shù)第二次分裂中期才具備受精能力。獲能的精子與該時期的次級卵母細胞相遇后。發(fā)生頂體反應(yīng)，釋放出頂體酶，溶解卵丘細胞間的物質(zhì)，形成一條通道。隨后，與透明帶接觸，頂體酶在透明帶中再次溶出一條孔道。精子通過頂體酶溶解出的兩條通道與卵黃膜接觸，立即發(fā)生透明帶反應(yīng)以妨礙其他精子通過透

15、明帶，這是防止多個精子進入卵細胞的第一道屏障。精子與卵黃膜接觸后，被其表面大量的微絨毛抱合，隨后，精子外膜與卵黃膜發(fā)生融合（利用了細胞膜的流動性這一特征），精子的尾脫落，細胞核進入卵細胞。精子入卵后，卵細胞隨即發(fā)生卵黃膜封閉作用（是阻止多精受精的第二道屏障）并被激活進行減數(shù)第二次分裂，排出第二極體。同時發(fā)生的還有，精子的細胞核核膜破裂，重新形成一個更大的細胞核，稱雄原核。減數(shù)第二次分裂后的卵細胞形成的細胞核，稱雌原核（通常雄原核比雌原核大）。兩原核相互靠近并彼此融合，最后則形成了一個二倍體（對人和大多數(shù)哺乳動物而言）合子，受精過程基本完成。注：受精過程在輸卵管中完成。卵裂：精子與卵子結(jié)合之后會

16、形成受精卵，由于卵黃的分布具有不對稱的特性，因此受精卵可以分為動物極（會發(fā)展成外胚層）和植物極（會發(fā)展成中胚層與內(nèi)胚層）。在卵裂時期，受精卵會先分裂成兩個細胞，之后細胞通常會逐次倍增，但是對哺乳類而言，有時候會有不同時分裂并造成只有奇數(shù)個細胞的現(xiàn)象。在這個階段，胚胎的總體積大致不變。細胞分裂成16到32個細胞的階段，稱為桑椹胚（morula），在這個階段，動物極的分裂頻率會超越靠近植物極且具有卵黃的細胞群。到了32個以上細胞數(shù)目的階段，稱為囊胚（blastula），囊胚內(nèi)部靠近動物極的區(qū)域會形成一個囊胚腔。體外受精體外受精(In Vitro Fertilization)或（external f

17、ertilization）是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為IVF。由于它與胚胎移植技術(shù)(ET)密不可分，又簡稱為IVF-ET。在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tube animal)。這項技術(shù)成功于20世紀50年代，在最近20年發(fā)展迅速，現(xiàn)已日趨成熟而成為一項重要而常規(guī)的動物繁殖生物技術(shù)引。三核移植核移植是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動物體內(nèi)的方法。核移植的細胞來源主要分為：供體細胞

18、來源和受體細胞的來源兩種。核移植主要用于細胞移植和異種器官移植，細胞移植可以治療由于細胞功能缺陷所引起的各種疾病。具體方法1供體核的獲得 培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至1050代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。2受體細胞去核用M中期卵母細胞做受體細胞原因： 細胞體積大,易于操作; 含有促進細胞核全能性表達的物質(zhì)和 營養(yǎng)條件。 為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，

19、必須將受體細胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?核卵重組 4細胞融合/激活 5重構(gòu)胚培養(yǎng)與移植克隆先將含有遺傳物質(zhì)的供體細胞的核移植到去除了細胞核的卵細胞中，利用微電流刺激等使兩者融合為一體，然后促使這一新細胞分裂繁殖發(fā)育成胚胎，當胚胎發(fā)育到一定程度后，再被植入動物子宮中使動物懷孕，便可產(chǎn)下與提供細胞核者基因相同的動物。這一過程中如果對供體細胞進行基因改造，那么無性繁殖的動物后代基因就會發(fā)生相同的變化。 克隆技術(shù)不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的結(jié)合，只需從動物身上提取一個單細胞，用人工的方法將其培養(yǎng)成胚胎，再將胚胎植入雌性動物體內(nèi)，就可孕育出新的個體。這種以單細胞培養(yǎng)出來的克隆動物，具有與單細胞供

20、體完全相同的特征，是單細胞供體的“復(fù)制品”。治療性克?。╰herapeutic cloning）治療性克隆指把患者植體細胞移到去核卵母細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚，然后從囊胚內(nèi)分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型(如神經(jīng)細胞，肌肉細胞和血細胞），用于替代療法。這種方法的最終目的是用于干細胞治療，而非得到克隆個體。運用克隆技術(shù)獲得人體早期胚胎，但目的不是將胚胎培育成人，而是為了提取全能型的胚胎干細胞，然后在合適的條件下，使其發(fā)育成為人體的任何一個器官，包括大腦、肌肉、血液和神經(jīng)，這些器官組織將用于醫(yī)療。目前治療性克隆已獲得不少國家的默許。生殖性克?。╮epr

21、oductive cloning）就是以產(chǎn)生新個體為目的的克隆。即用生殖技術(shù)制造完整的克隆人。目的是產(chǎn)生一個獨立生存的個體。于此相對的是研究性克隆或醫(yī)學(xué)性克隆，指的是產(chǎn)生研究所用的克隆細胞。不產(chǎn)生可獨立生存的個體?？寺∪?，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一樣可怕嗎？實際上，人們不能接受克隆人實驗的最主要原因，在于傳統(tǒng)倫理道德觀念的阻礙。千百年來，人類一直遵循著有性繁殖方式，而克隆人卻是實驗室里的產(chǎn)物，是在人為操縱下制造出來的生命。尤其在西方，“拋棄了上帝，拆離了亞當與夏娃”的克隆，更是遭到了許多宗教組織的反對。而且，克隆人與被克隆人之間的關(guān)系也有悖于傳統(tǒng)的由血緣確定親緣的倫理方式。所有這些，都使得克隆

22、人無法在人類傳統(tǒng)倫理道德里找到合適的安身之地。但是，正如中科院院士何祚庥所言：“克隆人出現(xiàn)的倫理問題應(yīng)該正視，但沒有理由因此而反對科技的進步”。人類社會自身的發(fā)展告訴我們，科技帶動人們的觀念更新是歷史的進步，而以陳舊的觀念來束縛科技發(fā)展，則是僵化。歷史上輸血技術(shù)、器官移植等，都曾經(jīng)帶來極大的倫理爭論，而當首位試管嬰兒于1978年出生時，更是掀起了軒然大波，但現(xiàn)在，人們已經(jīng)能夠正確地對待這一切了。這表明，在科技發(fā)展面前不斷更新的思想觀念并沒有給人類帶來災(zāi)難，相反地，它造福了人類。就克隆技術(shù)而言，“治療性克隆”將會在生產(chǎn)移植器官和攻克疾病等方面獲得突破，給生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)帶來革命性的變化。比如，

23、當你的女兒需要骨髓移植而沒有人能為她提供；當你不幸失去5歲的孩子而無法擺脫痛苦；當你想養(yǎng)育自己的孩子又無法生育也許你就能夠體會到克隆的巨大科學(xué)價值和現(xiàn)實意義。治療性克隆的研究和完整克隆人的實驗之間是相輔相成、互為促進的，治療性克隆所指向的終點就是完整克隆人的出現(xiàn)，如果加以正確的利用，它們都可以而且應(yīng)該為人類社會帶來福音。四RNA 沉默(RNA silencing)或基因沉默(gene silencing)是廣泛存在于植物、動物、線蟲和真菌等真核生中的一種高度保守的、序列特異的 RNA 降解機制. RNA 沉默對于調(diào)控發(fā)育、維持基因組的穩(wěn)定性以響應(yīng)生物和非生物脅迫等具有重要作用.作用植物可利用

24、PTGS 和 TGS 來抵抗病毒侵染, 病毒侵染植物后會產(chǎn)生大量病毒來源的小 RNA (virus-derived small interfering RNAs, vsiRNA), 介導(dǎo)對病毒 RNA 的降解或抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄; 而在與植物長期共進化過程中, 病毒編碼一個或多個RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing, VSR)來抑制植物的基因沉默, 從而逃脫植物的這種防衛(wèi)反應(yīng). 近年來, 針對病毒基因沉默抑制子作用機制的研究表明, 病毒編碼的基因沉默抑制子通過與植物基因沉默通路中的RNA或者關(guān)鍵蛋白分子相互作用, 抑制植物對病毒的抵抗, 干擾植物

25、正常的基因表達調(diào)控. 深入了解 vsiRNAs 的起源與組成、調(diào)控基因表達的潛力, 以及病毒編碼的基因沉默抑制子的作用機制, 將有助于我們更好地了解植物與病毒之間是通過怎樣復(fù)雜的相互作用來實現(xiàn)共同進化的, 進而為植物病毒控制提供新的策略.五轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器是基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，使外源基因?qū)雱游锘蚪M中并定位表達于動物乳腺，利用動物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在動物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價值產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因動物的總稱?，F(xiàn)有的應(yīng)用于動物乳腺生物反應(yīng)器制備的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有：1 顯微注射法2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法3 配子介導(dǎo)法4 胚胎干細胞（ES）介導(dǎo)法5 核移植介導(dǎo)法還有利用同源重組原

26、理發(fā)展起來的基因打靶（敲除）技術(shù)，結(jié)合體細胞克隆，正成為動物乳腺生物反應(yīng)器制備的新研究熱點。轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Genetically Modified，簡稱GM），是指運用科學(xué)手段，將基因片段轉(zhuǎn)入特定生物中，并最終獲取具有特定遺傳性狀個體的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于分子生物學(xué)。基因片段的來源可以是提取特定生物體基因組中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段?；蚱伪晦D(zhuǎn)入特定生物中，與其本身的基因組進行重組，再從重組體中進行數(shù)代的人工選育，從而獲得具有特定的遺傳性狀個體。該技術(shù)可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。轉(zhuǎn)基因過程(1)從生物有機體復(fù)雜的基因組中,分離出帶

27、有目的基因的DNA片段；或者人工合成目的基因。(2)在體外, 將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標記的載體分子上， 形成重組DNA分子。(3)將重組DNA分子引入到受體細胞(亦稱宿主細胞或寄主細胞) 。(4)帶有重組體的細胞擴增，獲得大量的細胞繁殖體。(5)從大量的細胞繁殖群體中，篩選出具有重組DNA分子的細胞克隆。(6)將選出的細胞克隆的目的基因進一步研究分析,并設(shè)法使之實現(xiàn)功能蛋白的表達。載體（vector） ，指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。必備條件在宿主細

28、胞中能保存下來并能大量復(fù)制，且對受體細胞無害，不影響受體細胞正常的生命活動。有多個限制酶切點，而且每種酶的切點最好只有一個，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶的單一識別位點，可適于多種限制酶切割的DNA插入。含有復(fù)制起始位點，能夠獨立復(fù)制；通過復(fù)制進行基因擴增，否則可能會使重組DNA丟失。有一定的標記基因，便于進行篩選。如大腸桿菌的pBR322質(zhì)粒攜帶氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，就可以作為篩選的標記基因。一般來說，天然運載體往往不能滿足上述要求，因此需要根據(jù)不同的目的和需要，對運載體進行人工改建。現(xiàn)在所使用的質(zhì)粒載體幾乎都是經(jīng)過改建的。載體DNA分子大小應(yīng)合適，以便操作?；蚩寺〉妮d體類型：質(zhì)粒載體，噬菌體載體，柯斯質(zhì)粒載體