研究捷安肽素抗真菌作用機(jī)理

1、研究捷安肽素抗真菌作用機(jī)理    【摘要】  目的 研究捷安肽素的抗真菌作用機(jī)理。方法 采用形態(tài)學(xué)方法和同位素標(biāo)記法。顯微形態(tài)觀察經(jīng)捷安肽素處理后的供試真菌的形態(tài)學(xué)變化。進(jìn)一步采用14C同位素標(biāo)記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對(duì)真菌(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性反應(yīng)的影響。結(jié)果 顯微形態(tài)觀察表明，經(jīng)捷安肽素處理后，供試真菌呈現(xiàn)球形膨脹，而且隨著捷安肽素作用強(qiáng)度增強(qiáng)，球形膨脹的程度和發(fā)生頻率也增加，提示捷安肽素的作用位點(diǎn)在真菌細(xì)胞壁。同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，捷安肽素可抑制（1,

2、3）-D-葡聚糖合成酶的活性，降低真菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中（1,3）-D-葡聚糖的放射性摻入，對(duì)疫霉菌和辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的抑制率分別達(dá)到77.7%和77.5%。結(jié)論 捷安肽素的抗真菌作用機(jī)理為：抑制細(xì)胞（1,3）-D-葡聚糖合成酶的活性，破壞真菌細(xì)胞壁的合成，造成真菌細(xì)胞壁組分（1,3）-D-葡聚糖的缺損和病原真菌生長(zhǎng)抑制。  【關(guān)鍵詞】  捷安肽素；抗真菌作用機(jī)理；（1,3）-D-葡聚糖合成酶     Abstract：Objective To inve

3、stigate the antifungal mechanism of Jiean-peptide.Methods The mode of action of Jiean-peptide against 4 phytopathogenic filamentous fungi associated with phytopathy:Phytophthora sp.,Colletotrichum

4、0;gossypii,Southw Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was investigated by the method of morphology and isotope labelling.The (1,3)-D-glucan synthase assay was processed 

5、using isotope labelled substrateurdine diphosphate(14C)glucose to study the effect of Jiean-peptide on fungal(1,3)-D-glucan synthase.Results Micrographic observation revealed that the Jiean-peptide ma

6、de the hyphal expanded and globular.The(1,3)-D-glucan synthase assay showed Jiean-peptide could inhibit the activity of(1,3)-D-glucan synthase and reduce the radioactivity incorporation of(1,3)-D

7、-glucan.The inhibition percentages of Jiean-peptide against Phytophthora sp.and Colletotrichum gossypii Southw were 77.7% and 77.5% respectively.Conclusion The antifungal mechanism of Jiean-peptide

8、60;was the inhibition of enzyme activity of(1,3)-D-glucan synthase.     Key words:Jiean-peptide；antifungal mechanism；(1,3)-D-glucan synthase       捷安肽素是一種由芽孢桿菌產(chǎn)生的抗真菌活性多肽，具有廣譜抗真菌活性，而且穩(wěn)定性好、抑菌持

9、久，具有很好的開(kāi)發(fā)前景1，2。從捷安肽素對(duì)疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多種常見(jiàn)重要植物病原真菌的抑菌性能可知，捷安肽素可以通過(guò)抑制真菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)而發(fā)揮抗真菌生長(zhǎng)作用。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，捷安肽素可以破壞真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使真菌細(xì)胞呈現(xiàn)原生質(zhì)球狀3。（1,3）-D-葡聚糖合成酶（EC2.4.1.34；尿苷二磷酸-葡萄糖/(1,3)-D-葡聚糖-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶）是一細(xì)胞膜結(jié)合酶，在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)聚合UDPG形成葡聚糖纖維，葡聚糖纖維分泌出細(xì)胞膜形成網(wǎng)狀支架，對(duì)真菌細(xì)胞壁的完整性及保護(hù)真菌抵抗低滲透壓起重要作用4，5。本文作者采用形態(tài)學(xué)方法和同位素標(biāo)記法研究捷安肽素對(duì)真菌細(xì)胞壁及其（

10、1,3）-D-葡聚糖合成酶的作用，進(jìn)一步深入探討捷安肽素的抗真菌作用機(jī)理，為捷安肽素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。     1  材料     1.1  菌種     疫霉菌（Phytophthora sp.）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、棉花枯萎病菌（Fusarium 

11、;oxysporum f.sp.vasinfectum），均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。     1.2  培養(yǎng)基     馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基。     1.3  主要試劑     捷安肽素原液（生物效價(jià)為19.5 mm）由本實(shí)驗(yàn)室提供；尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖UDP-（14C）-G，Perkin-Elmer進(jìn)口產(chǎn)品；2,5-二苯基&#

12、160; 唑（2,5-Di-phenyloxazole,PPO），F(xiàn)isher進(jìn)口產(chǎn)品。（捷安肽素的生物效價(jià)采用管碟法2測(cè)定，以疫霉菌為檢驗(yàn)菌株，以抑菌圈直徑為效價(jià)指標(biāo)）。     1.4  主要溶液     粗酶提取緩沖液5×10-2mol/L Tris-HCl pH7.5,1mol/L葡萄糖，1×10-3mol/L EDTA，5×10-3mol/L MgCl2,1×10-2mol/L

13、 NaF,層析展開(kāi)劑95%乙醇,1mol冰醋酸（73，V/V）,閃爍液1g PPO，200 ml甲苯。     1.5  主要儀器     SHZ-82大容量回旋振蕩器  德國(guó)ZAISS,AXIOPLAN2型多功能顯微鏡,PHS-3精密數(shù)顯酸度計(jì)Sigma 3K30高速冷凍離心機(jī),FJ-353G1型雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器等。     2  方法

14、0;2.1  捷安肽素作用下供試菌的形態(tài)觀察     將疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基(終孢子濃度為106個(gè)/ml)，25150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。每隔2 h取樣，用0.05%的乳酚藍(lán)染色液對(duì)樣品進(jìn)行固定、染色、顯微觀察孢子萌發(fā)情況和菌絲生長(zhǎng)情況。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，捷安肽素的處理濃度分別為原液濃度、1/2原液濃度和空白對(duì)照。     2.2  捷安肽素樣品的處理  

15、   將捷安肽素樣品分為兩組，組不做任何處理,生物效價(jià)為19.5 mm；組用30%的NaOH調(diào)pH為10，再以15%的HCl調(diào)pH為7.5，生物效價(jià)為零。     2.3  制備（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液     分別接種疫霉菌和辣椒炭疽病菌于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，疫霉菌30、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h；辣椒炭疽病菌25、150 r/min振蕩培養(yǎng)36h,收集培養(yǎng)液，離心洗滌獲得菌絲體。

16、(1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備采用文獻(xiàn)6的方法，經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)。液氮研磨菌絲體后加入粗酶提取緩沖液，充分振蕩混勻于4、3 500g離心10 min。收集上清夜，再將上清液于4、50 000g離心45 min。所得沉淀為粗酶制品,懸浮于503×103mol/L Tris-Hcl pH 7.5（含33%的甘油）中，用Bradford法測(cè)定酶蛋白含量，蛋白濃度控制在35 g/l,于-70保存?zhèn)溆谩?#160;    2.4  （1,3）-D-葡聚

17、糖合成酶粗酶的活性測(cè)定    采用14C標(biāo)記的特異底物UDPG，與(1,3)-D-葡聚糖合成酶進(jìn)行酶反應(yīng)，閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物(1,3)-D-葡聚糖的放射性，確定(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的活性。     2.4.1  (1,3)-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)7     反應(yīng)體系40l，包括253×103mol/L Tris-HCl pH7.5,0.5 mol/L葡萄糖，103×103m

18、ol/L NaF,5 mg/ml BSA,740 Bq UDP-（14C）-G和10 l(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液。以加入10 l雙蒸水的反應(yīng)組作為(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的空白對(duì)照組，以加入10 l沸水浴30 min滅活的粗酶液的反應(yīng)組作為(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰性對(duì)照組。每組反應(yīng)重復(fù)2次。反應(yīng)系統(tǒng)于30保溫30 min，最后加入4 l冰乙酸終止反應(yīng)。     2.4.2  (1,3

19、)-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)產(chǎn)物的分離和放射性測(cè)定    反應(yīng)終止后，按文獻(xiàn)8的方法進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分離。將反應(yīng)液點(diǎn)樣于新華3號(hào)濾紙上，下行層析過(guò)夜。取出濾紙風(fēng)干，剪下原點(diǎn)，于FJ-353G1型雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘閃爍次數(shù)（Cpm），表示同位素標(biāo)記的(1,3)-D-葡聚糖的放射性強(qiáng)度，并以此衡量(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性。FJ-353G1型雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)C14探測(cè)效率大于70%；閃爍液放射本底小于60 次/min。     2.5  捷安肽素對(duì)（1,3）-D-

20、葡聚糖合成酶反應(yīng)的影響    按2.3方法進(jìn)行捷安肽素影響下的(1,3)-D-葡聚 糖合成酶反應(yīng)和產(chǎn)物分離與放射性檢測(cè)。反應(yīng)設(shè)置3組：捷安肽素處理組、捷安肽素處理組和捷安肽素空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中捷安肽素或雙蒸水加樣量均為2l，每組重復(fù)10次。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的放射性計(jì)算產(chǎn)物的放射性摻入率和捷安肽素對(duì)酶反應(yīng)的抑制率。摻入率=處理組產(chǎn)物放射性/對(duì)照組產(chǎn)物放射性×100%，抑制率=1-摻入率。2.6  數(shù)據(jù)處理     采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析。

21、     3  結(jié)果與分析     3.1  捷安肽素對(duì)各病原菌形態(tài)的影響     光學(xué)顯微鏡觀察捷安肽素作用下各病原真菌的菌絲和孢子形態(tài)（0.05%的乳酚藍(lán)染色液染色），可見(jiàn)供試真菌的孢子和菌絲形態(tài)有顯著的變化，孢子和菌絲體膨大、畸形、原生質(zhì)凝聚、孢子不萌發(fā)或萌發(fā)異常、菌絲上產(chǎn)生大量球形膨脹泡囊、生長(zhǎng)受阻。隨著捷安肽素處理的時(shí)間增長(zhǎng)或濃度加大這種球形膨脹的程度和發(fā)生頻率也增大。圖1所示為培養(yǎng)24h的供試病

22、原真菌,捷安肽素處理濃度為1/2原液濃度，其中對(duì)照菌絲表面光滑、結(jié)構(gòu)完整，處理菌絲均呈現(xiàn)不同程度的球形膨脹。眾所周知，真菌的細(xì)胞壁是細(xì)胞規(guī)范和維持形態(tài)所必需的,一旦細(xì)胞壁受損，細(xì)胞的原生質(zhì)體在胞內(nèi)滲透壓的作用下，便會(huì)形成球狀。由此推測(cè)捷安肽素破壞了供試真菌的細(xì)胞壁，從而使之呈現(xiàn)球形膨脹。     3.2  （1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備和活性    采用2.3方法制備出疫霉菌和辣椒炭疽病菌菌絲的（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液，經(jīng)檢驗(yàn)該（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰

23、性對(duì)照組與空白對(duì)照組結(jié)果相同，反應(yīng)產(chǎn)物的放射性均小于60 Cpm，為閃爍液本底值，沒(méi)有酶活；實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)產(chǎn)物的放射性為3 0005 000 Cpm，表明（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶具有催化活性，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。     3.3  捷安肽素對(duì)（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)的影響    按照方法2.5，采用14C同位素標(biāo)記的特異底物“UDP-（14C）-G”示蹤，用捷安肽素      

24、;     處理（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物（1,3）-D-葡聚糖的放射性。結(jié)果表明疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，處理組、的放射性摻入（%空白對(duì)照）分別為22.3%±2.8%和96.0%±0.8%；辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，處理組、的放射性摻入（%空白對(duì)照）分別為22.5%±2.5%和74.7%±3.0%，見(jiàn)圖2。     圖2  捷安肽素對(duì)（1,3）-D-葡聚糖放射性摻入的影響

25、60;    Fig.2  The effects of Jiean-peptide on(1,3)-D-glucans radioactive incorporation     如圖2所示，在疫霉菌和辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組、的放射性摻入均低于空白對(duì)照組，但其各自的組間差異不同。進(jìn)一步采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異是否顯著，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表

26、1  捷安肽素對(duì)疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影響從表1可知，疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組和處理組之間、捷安肽素處理組和空白對(duì)照組之間均差異顯著（P10.01,P20.01,n=10），處理組和空白對(duì)照組之間差異不顯著（P30.05,n=10），表明捷安肽素處理組可抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率為77.7%±2.8%；捷安肽素處理組不能抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率4%±0.8%屬于實(shí)驗(yàn)誤差，不具有統(tǒng)計(jì)意義。表2  捷安肽素對(duì)辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影響從表2可知，辣椒炭疽病菌（

27、1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組、處理組、空白對(duì)照組相互之間均差異顯著（P10.01，P20.01, P30.01,n=10），表明捷安肽素處理組和捷安肽素處理組均可抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率分別為77.5%±2.5%和25.3%±3.0%。     在本實(shí)驗(yàn)中，捷安肽素處理組(效價(jià)為19.5mm)對(duì)辣椒炭疽病菌和疫霉菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶均具有抑制作用，這與它擁有生物活性的特性相一致。而捷安肽素處理組的效價(jià)為零，即沒(méi)有生物活性，但它對(duì)辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶卻表現(xiàn)

28、出了抑制作用。分析原因可能是因?yàn)榻莅搽乃氐纳镄r(jià)測(cè)試菌為疫霉菌，捷安肽素?zé)o生物活性只是相對(duì)疫霉菌而言。而辣椒炭疽病菌對(duì)捷安肽素的敏感性不如疫霉菌對(duì)捷安肽素的敏感性高3，所以對(duì)于同一濃度捷安肽素處理，辣椒炭疽病菌的酶反應(yīng)受抑，疫霉菌的酶反應(yīng)不受抑制。     4  討論     隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，放射性核素正廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等學(xué)科的各個(gè)領(lǐng)域，大大地推動(dòng)這些學(xué)科進(jìn)入分子水平的新階段。酶的放射性分析方法9即是采用放射性標(biāo)記底物與酶液在適宜的條件下保溫一段時(shí)

29、間后，分離、測(cè)定酶催化底物所生成的產(chǎn)物的放射性而確定酶活性，是生物研究中最常用的方法。其它細(xì)胞壁相關(guān)酶類的分析法包括生物化學(xué)法、原位分析法、熒光染色等，但都不如放射性分析方法靈敏、快速、簡(jiǎn)便。因此，本實(shí)驗(yàn)采用酶的放射性分析方法研究捷安肽素的抗真菌作用機(jī)理：從疫霉菌和辣椒炭疽病菌中提取細(xì)胞壁合成中重要的（1,3）-D-葡聚糖合成酶，采用14C放射性標(biāo)記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對(duì)(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的影響。     已知抗真菌多肽的作用機(jī)理主要有兩種10：一種是干擾真菌的細(xì)胞壁組分葡聚糖、幾丁質(zhì)和各

30、種甘露蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁的缺損。如棘白霉素類化合物能結(jié)合-1,3-D-葡聚糖合成酶復(fù)合體的Fksp亞基而干擾-1,3-D-葡聚糖的合成，發(fā)揮抗真菌作用11。另一種是在細(xì)胞膜上形成電勢(shì)依賴的或其它的通道，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露。陳剛、裴炎等通過(guò)檢測(cè)抗真菌多肽APS對(duì)脂質(zhì)平面膜電學(xué)性質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)APS可在細(xì)胞膜上持續(xù)形成孔道（pores），破壞膜的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)容物的外流，最終導(dǎo)致真菌的死亡12。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，捷安肽素可使疫霉菌和辣椒炭疽病菌的-1,3-D-葡聚糖合成酶的反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入率降低。由此推測(cè)捷安肽素可能的抗真菌機(jī)理是：抑制真菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶活性

31、，造成真菌細(xì)胞壁組分（1,3）-D-葡聚糖的缺損，破壞真菌細(xì)胞壁的完整性，造成病原真菌生長(zhǎng)抑制。真菌的細(xì)胞壁合成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及許多酶類13，捷安肽素對(duì)真菌細(xì)胞壁合成相關(guān)的其它酶類如幾丁質(zhì)合成酶等的酶活性有無(wú)作用還有待進(jìn)一步研究。     植物真菌病害是目前較難防治的農(nóng)作物病害，一直制約著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。而過(guò)度地大量使用化學(xué)農(nóng)藥，已造成了全球生態(tài)環(huán)境的不斷惡化及糧食危機(jī)，發(fā)展無(wú)公害生物農(nóng)藥已是大勢(shì)所趨。捷安肽素抗真菌作用機(jī)理的初步闡明，有助于捷安肽素作用機(jī)理的更深層次的研究，有助于建立農(nóng)用抗菌素的篩選模型、利用分子設(shè)計(jì)手段進(jìn)行分子的改

32、造和新的抗菌物質(zhì)的合成，同時(shí)為捷安肽素開(kāi)發(fā)為新型生物農(nóng)藥提供生產(chǎn)、制劑、使用等方面的理論依據(jù)。同時(shí)，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，捷安肽素對(duì)真菌細(xì)胞壁合成的抑制作用，為捷安肽素向人藥發(fā)展提供了可能。 【參考文獻(xiàn)】   1ZHONG Juan,ZHOU Jinyan,TANG Hong.Mutation Breeding of a Strain Producing High-yield Jiean-peptide,an Antifungal P

33、eptideJ.Chin J Appl Environ Biol,2004,10(1):104-107. 2LAI Yana,TAN Hong.Fermentation Conditions for Antifungal Polypeptide Jiean-peptideJ.Chin J Appl Environ Biol,2004,10(2):231-235. 3DAI Fuying,ZHONG Juan

34、,ZHOU Jinyan,et al.Inhibition Property of a Novel Antifungal Polypeptide Jiean-peptideJ.Chinese Journal of Antibiotics, 2005,9:516-520. 4CM Douglas.Fungal -(1,3)-D-glucan SynthesisJ.Med.Myco l,2001,39:55-66.

35、60;5Hans de Nobel,Herman van den Ende,Frans M.Klis.Cell Wall Maintenance in FungiJ.Trends in Microbiology,2000,8(8):344-345. 6Luis Antelo,Eric G.Cosio,Norbert Hertkorn,et al.Partial Purification of a GTP-insensitive(13)-glucan Synthase from Phytophthora SojaeJ.FEBS Letters,1998,433:191-195. 7CM Douglas,JA Marrinan,W Li,et al.A Saccharomyces Cerevisiae Mutant with Echinocandin-resistant 1,3-b