雞蛋中三聚氰胺的表面解吸常壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜法成像

1、雞蛋中三聚氰胺的表面解吸常壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜法成像楊水平1 陳煥文1,2,* 楊宇玲1 胡 斌1 張 燮1 周瑜芬1 張麗麗21（東華理工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，撫州 344000）2（吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130023）摘要以表面解吸常壓化學(xué)電離（SDAPCI）串聯(lián)質(zhì)譜中獲得的三聚氰胺特征碎片離子（m/z 85）為指針，對(duì)熟雞蛋切面進(jìn)行二維質(zhì)譜掃描，用不同顏色表示三聚氰胺信號(hào)強(qiáng)度的高低，獲得了熟雞蛋切面中三聚氰胺的質(zhì)譜影像。三聚氰胺的空間分辨率達(dá)0.06 mm2，最小采樣面積占成像面積的百萬(wàn)分之50。圖像表明蛋清中含有絕大部分三聚氰胺（99.8%以上），但分布仍然不均勻；而蛋黃中基本不含三聚氰胺。

2、關(guān)鍵詞表面解吸常壓化學(xué)電離；串聯(lián)質(zhì)譜；成像；三聚氰胺；雞蛋1 引 言質(zhì)譜學(xué)方法是一種同時(shí)具備高特異性和高靈敏度的普適性方法，而利用新興質(zhì)譜技術(shù)在無(wú)需任何樣品前處理的情況下對(duì)生物組織的成像則是當(dāng)前研究的前沿和熱點(diǎn)之一。質(zhì)譜成像屬于分子成像技術(shù)之一，可以對(duì)樣品x, y, z不同維度方向順次進(jìn)行質(zhì)譜掃描，獲得各點(diǎn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后用不同顏色代表某一探測(cè)組分含量的高低，按其空間位置作出質(zhì)譜影像圖。顯然，采樣點(diǎn)的面積越小，表明影像圖的空間分辨率越好；質(zhì)譜強(qiáng)度分辨率越高，則需要的顏色種類(lèi)越多。與常規(guī)的光譜影像不同，質(zhì)譜能夠?qū)μ囟ǖ哪骋换瘜W(xué)成分進(jìn)行成像，甚至獲得超低含量組分的空間分布信息，提供其它方法無(wú)法獲得

3、的豐富的分子層次的影像信息，對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。常用于成像的質(zhì)譜技術(shù)是基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）1,2，但一般在真空下進(jìn)行。利用電噴霧解吸電離質(zhì)譜（DESI-MS）35可在常壓下對(duì)生物組織成像，但一般利用一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行。我們自行研制的表面解吸常壓化學(xué)電離（SDAPCI）源610具有較高的靈敏度，能夠在串聯(lián)質(zhì)譜中獲得痕量待測(cè)物的特征離子，從而可以排除采用一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)成像可能存在的干擾。在采用光譜和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)食品中三聚氰胺的快速檢測(cè)11研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)三聚氰胺與蛋白質(zhì)具有特殊的親和作用。本實(shí)驗(yàn)首次采用SDAPCI-MS/MS中三聚氰胺的特征碎片為信號(hào)，在無(wú)需樣品預(yù)處理?xiàng)l件

4、下獲得了雞蛋切面的三聚氰胺分布影像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞蛋中三聚氰胺都集中分布在蛋清中。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑SDAPCI離子源：實(shí)驗(yàn)室自制610，配有可控溫解吸氣加熱裝置，解吸氣出口噴嘴直徑為0.1 mm，其中的放電針直徑為0.05 mm，空間分辨率約為0.25×0.25 (0.06) mm2。LTQ XL增強(qiáng)型線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀，配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Finnigan公司）。三聚氰胺（分析純，天津博迪化工有限公司），使用時(shí)配置成10.0 mg/kg水溶液備用。雞蛋樣品購(gòu)于某地超市，常規(guī)方法煮熟后冷卻，去殼后切成厚約5 mm的切片，備用。2.2 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置SDAPCI離子

5、源為正離子檢測(cè)模式，質(zhì)量范圍為50220 Da，電離電壓為3.0 kV，離子傳輸管溫度為275 ；解吸氣(N2)氣壓為0.2 MPa，從裝有水的錐形瓶通過(guò)，以為30°角噴出，解吸氣溫度為200。實(shí)驗(yàn)時(shí)小心地將雞蛋切片置于具有三維調(diào)節(jié)功能的樣品臺(tái)上，使解吸氣出口到測(cè)定點(diǎn)距離為12 mm，測(cè)定時(shí)線(xiàn)性地改變樣品臺(tái)位置，每間隔0.25 mm采集一次數(shù)據(jù)。二級(jí)質(zhì)譜記錄時(shí)間為10 s，選定離子的隔離寬度為1.6 Da，碰撞能量為36%，其它條件系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。記錄各采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)二級(jí)質(zhì)譜中m/z 85碎片離子凈響應(yīng)信號(hào)的平均值，將各點(diǎn)數(shù)據(jù)（z值）按其相應(yīng)空間坐標(biāo)位置（x, y）輸入Excel工作表中，

6、由Excel軟件作出三維曲面圖，設(shè)置視圖格式為90°仰角，即獲得影像圖。、2結(jié)果與討論2. 1雞蛋中三聚氰胺的定性鑒定按擬定實(shí)驗(yàn)方法對(duì)生雞蛋清進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，在一級(jí)質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)子化的三聚氰胺（m/z 127），其二級(jí)質(zhì)譜中存在特征離子m/z 110, m/z 85, m/z 68和m/z 60等（如圖1所示），與文獻(xiàn)報(bào)道一致11，表明蛋清中存在三聚氰胺。但是，雞蛋黃的一級(jí)質(zhì)譜雖然有疑似信號(hào)（m/z 127），但在二級(jí)質(zhì)譜中無(wú)法獲得m/z 85, 68等信號(hào)。因此，表明雞蛋黃中不含有三聚氰胺12。熟雞蛋質(zhì)譜鑒定結(jié)果與生雞蛋結(jié)果一致。采用二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子m/z 85的信號(hào)強(qiáng)度為指標(biāo)，對(duì)

7、各個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。值得注意的是離子源出口到樣品測(cè)定點(diǎn)距離為12 mm，太近了信號(hào)不穩(wěn)定，太遠(yuǎn)了則影響空間分辨率。在實(shí)驗(yàn)條件下可獲得的空間分辨率為0.06 mm2，這可能與所用的噴嘴孔徑較小和氣體壓力較低有關(guān)。圖1 含有三聚氰胺的雞蛋的一級(jí)質(zhì)譜和質(zhì)子化三聚氰胺（m/z 127）的二級(jí)譜圖Fig. 1 SDAPCI-MS spectrum of a melamine tainted egg sample, the inset shows the MS/MS spectrum of ions detected at m/z 1272. 2 三聚氰胺在熟雞蛋切面的質(zhì)譜影像按實(shí)驗(yàn)方法獲得熟雞蛋

8、切面（近似圓形，半徑為19.9 mm，面積約1244.1 mm2）上三聚氰胺的質(zhì)譜影像，見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，雞蛋的質(zhì)譜影像呈現(xiàn)出與雞蛋切面類(lèi)似的輪廓，二者的尺寸和形狀完全一致。但是，質(zhì)譜影像與光譜影像（即照片）不同，照片中看到的是各種物質(zhì)反射光譜成像的結(jié)果，無(wú)法從中獲得特定物質(zhì)如三聚氰胺的空間分布。理論上，質(zhì)譜影像可以獲得各個(gè)不同待測(cè)物的空間分布，獲得豐富的分子層次的信息，具有常規(guī)光譜成像（如照相）難以比擬的優(yōu)點(diǎn)。但圖2中的質(zhì)譜影像僅僅是三聚氰胺在雞蛋中的分布情況，因?yàn)橥ㄟ^(guò)二級(jí)質(zhì)譜把其它非三聚氰胺信號(hào)屏蔽了。圖2表明雖然肉眼或普通的照片無(wú)法展現(xiàn)，但三聚氰胺在雞蛋中分布極不均勻，一枚雞蛋中的三聚

9、氰胺都集中在蛋白中，占三聚氰胺含量的99.8%以上。蛋白區(qū)的主要成分是各種蛋白質(zhì)。三聚氰胺中含有多個(gè)氨基，能夠通過(guò)形成很強(qiáng)的氫鍵等與不同的蛋白質(zhì)相互作用，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的空間構(gòu)象合適時(shí)，甚至形成多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致難以在常溫下將三聚氰胺從蛋白中解吸出來(lái)。顯然，雞蛋中含有多種不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與三聚氰胺的結(jié)合能力不一定相同。質(zhì)譜影像表明，三聚氰胺在蛋白中分布也不均勻，煮熟后蛋白內(nèi)外表面的三聚氰胺含量相對(duì)較低，蛋白中間部分三聚氰胺含量升高，而且蛋白層越厚其中間部分的三聚氰胺含量越高（如影像中上部）。從圖2照片中可以看出，在蛋黃區(qū)的中心部分，有些微微泛白的區(qū)域（對(duì)應(yīng)于胚胎發(fā)育的臍帶部分），表明該區(qū)域含

10、有部分蛋白。在質(zhì)譜影像中，蛋黃區(qū)基本不含三聚氰胺，但只有在微微泛白的蛋黃中心區(qū)可觀察到很弱的信號(hào)。此外，從質(zhì)譜影像中還看到三聚氰胺有聚集分布的現(xiàn)象，導(dǎo)致三聚氰胺的相對(duì)含量差異達(dá)到3個(gè)多數(shù)量級(jí)。顯然，雞蛋在熟化過(guò)程中經(jīng)歷了蛋白質(zhì)變性等復(fù)雜的物理化學(xué)變化，這可能削弱部分蛋白質(zhì)與三聚氰胺的結(jié)合能力，導(dǎo)致三聚氰胺局部濃度變化。與均一的溶液不同，生雞蛋清中蛋白質(zhì)本身可能分布不均勻，如果三聚氰胺恰好與該蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的選擇性相互作用，則同樣可能導(dǎo)致三聚氰胺分布不均勻。雖然還需要深入研究才能夠?qū)θ矍璋返牟痪鶆蚍植嫉木唧w機(jī)理等提出合理的解釋?zhuān)撡|(zhì)譜影像已經(jīng)清晰地表明三聚氰胺能夠選擇性地與蛋白質(zhì)發(fā)生較強(qiáng)的相

11、互作用。圖2 雞蛋切面照片及其三聚氰胺分布影像（虛線(xiàn)表示質(zhì)譜影像在雞蛋中的相應(yīng)部位），空間分辨率為0.06 mm2，含量分辨率為0.9 mg/kg。Fig. 2 Picture and SDAPCI-MS/MS imaging of an egg containing melamine. The special resolution is 0.06 mm2, and the content resolution shown is 0.9 mg/kg實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本方法二級(jí)質(zhì)譜中m/z 85離子的凈信號(hào)的測(cè)量精度較高，多次測(cè)量的相對(duì)偏差為RSD=1.29%（n=6）。采用相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)

12、偏差（n=20，s=1.2），按S/N=3計(jì)算本方法直接測(cè)定雞蛋中的三聚氰胺的檢測(cè)限為0.045 mg/kg。計(jì)算表明圖2影像中三聚氰胺含量分辨率為0.9 mg/kg，如果采用專(zhuān)門(mén)的繪圖軟件，其含量分辨率可以大大提高。對(duì)所購(gòu)得的5個(gè)雞蛋樣品取蛋清按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，均檢測(cè)出三聚氰胺，其含量為1.365.0 mg/kg 。實(shí)驗(yàn)中空間分辨率達(dá)0.06 mm2，而所用雞蛋的面積達(dá)到約1244.1 mm2，單位采樣面積與成像面積的比（SIR）百萬(wàn)分之50。因此，本工作是迄今為止的質(zhì)譜成像中SIR最小的研究。初步實(shí)驗(yàn)表明，加熱解吸氣對(duì)雞蛋樣品中三聚氰胺的離子化及測(cè)定起重要作用，這可能與三聚氰胺與蛋白質(zhì)的強(qiáng)相

13、互作用有關(guān)。如進(jìn)一步減小離子源出口的直徑，減少解吸氣體的流速，則可以大大減小解吸氣噴在樣品上的解吸斑點(diǎn)的大小，（如直徑減小到0.05 mm），則可大大提高SDAPCI-MS質(zhì)譜成像的分辨率，有望廣泛地應(yīng)用于生物樣品的高分辨質(zhì)譜成像研究。References1 Caprioli R M, Farmer T B, Gile J. Anal. Chem., 1997, 69: 475147602 Todd P J, Schaaff T G., Chaurand P, Caprioli R M. J. Mass Spectrom., 2001, 36:3553693 Chen H W, Talaty

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