核酸的提取經(jīng)驗(yàn)及原理總結(jié)

1、一、核酸核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細(xì)胞最基本和最重要的成分。一般認(rèn)為， 生物進(jìn)化即始于核酸，因?yàn)樵谒猩镔|(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍(lán)圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾（F.Miescher）在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時稱之為核素。阿爾特曼 （R.AItmann）于1889年認(rèn)識其酸性后，定名為核酸。二、核酸的分類和功能核酸分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)，但生物功能不同。DNA貯存遺傳信息，在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制，使每個子細(xì)胞接受與母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信 息含量相同的

2、DNA ； RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負(fù)責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含 D-2-脫氧核糖（核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取 代）。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。三、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水

3、，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易 溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá) 40g/L, DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體 溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把 P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無機(jī)離子等，從中分離 DNA。四、細(xì)胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取過程中，細(xì)胞裂解是非常重要的。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 （如 SDS Trit on X-100、NP-40、Twee n 20 等）和鹽（如 Tris、EDTA

4、NaCI 等）。 鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境（如Tris）,還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞（如EDTA）維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（如NaCI）等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性， 破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段， 促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有 直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（如GIT、GuHCl等）裂解的，該方法已經(jīng)成為了RNA抽提的主流，卻不是基因組DNA抽提的主流。（二）細(xì)胞的裂解方法細(xì)菌細(xì)胞破碎方法有以下幾種：1）機(jī)械方法：超聲波

5、處理法、研磨法、勻漿法。關(guān)于超聲波處理法，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間。2）化學(xué)試劑法：用含 SDS或CTAB的溶液處理細(xì)胞，在一定的p H環(huán)境和變性條件下,細(xì) 胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相， p H環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿 （NaOH）或緩沖液（TE、STE等）提供，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑（EDTA等）可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子 Mg2+、Ca2+ , 從而抑制核酸酶的活性，保護(hù)核酸不被降解。3）反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在 -20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成

6、和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。個人經(jīng)驗(yàn)一般情況，37C ,3min,液氮3min,反復(fù)三次即可以。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶 K等，都可使 細(xì)胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的 3-（1 ,4）鍵水解。蛋白酶 K能催化水解多種多肽鍵,其 在65 C及有EDTA、尿素（14mol/ L）和去污劑（0. 5 %SDS或1 %Triton X-100） 存在時仍 保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中，酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合

7、使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。（三）裂解方法的評價含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組DNA的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì) 的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時，巨大的基因組DNA是很容易 纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組DNA纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組DNA的純度更高。另外一個思路是，如果基因組DNA與蛋白質(zhì) 纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組DNA的特性占優(yōu)勢，則純化時以DNA的形式被保

8、留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時 以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致DNA的損失。當(dāng)然去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡單的操作， 但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用PC抽提的差一些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑（如GIT、GuHCI等）的裂解方法，是抽提RNA的首選?？俁NA 的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì) 纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫σ院蟮募兓a(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高

9、濃 度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的RNA酶，從而確保了 RNA的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品-主要是植物，其它絕大部分樣品的RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。當(dāng)然有些樣品，如肌肉，即使是RNA抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)），原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。（即，蛋白質(zhì)含量過高的樣品抽提RNA也要用蛋白酶）該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。含CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組DNA抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是CTAB的質(zhì)量，

10、二是洗滌的徹底程度。CTAB的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还?司生產(chǎn)的純度一樣的CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除CTAB要比其它的鹽難一些，同時，CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用65C;但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低， 可以試一下 37C -45C這個相對低溫的區(qū)域。SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點(diǎn)。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效 率在4C會更好一些，所以，加入溶液III后

11、在4C靜置一段時間以及采用4C離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用PC純化，但結(jié)合 PC純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA的去除可以靠在溶液 I中加入RNase A （100ug/ml）或者在最后的溶 解液中加入 RNase A （25 ug/ml）來實(shí)現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液I中使用 RNase A, RNA的 殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除RNA殘留。另外，對大質(zhì)粒（50 kb以上），該方法可能會有問題。PCR模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品 被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,非?？焖?。也正因?yàn)椴患兓?，假陰性（?/p>

12、沒有擴(kuò)增出來的陽性）比例也比較高。該方法最簡單的就是反復(fù)凍融法，簡便快捷，不需任何 化學(xué)試劑，凍融離心，PCR檢測就可以了。如果使用裂解法，哪么最簡單的裂解液就是水， 復(fù)雜一點(diǎn)的就會含有一些不會抑制后續(xù)的PCR反應(yīng)，而且能提高裂解效率， 甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會 含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化 來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高

13、陽性率，因?yàn)闃悠妨康慕档停瑫r意味著PCR的抑制物量的降低。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低， 將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。五、核酸純化就個人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì) 的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開（PEG沉淀和LiCl沉淀除外）。1）經(jīng)典的使用苯酚/

14、氯仿抽提的純化技術(shù)：細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相， 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇 （25 : 24 : 1體積）混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng) 漩渦振蕩混勻（適用于分離小分子量核酸）或簡單顛倒混勻（適用于分離高分子量核酸 ） 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有 機(jī)溶劑，預(yù)先要用 STE緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。 酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；故在 制備酚飽和液時要加入一特殊物質(zhì)，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì) 變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可

15、被一些 有機(jī)溶劑沉淀，通過沉淀可濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5，終濃度為0.3M的NaAc或KAc后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷， 在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入22. 5倍體積的乙醇，經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機(jī)溶劑（異丙醇、聚乙二醇（PEG）等）和鹽類（10. Omol/L醋酸銨、8. Omol/L的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等 ）也用于 核酸的沉淀。2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì) 上；洗滌去除殘留的

16、雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的 乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后， 用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4）密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認(rèn)為是純化大量質(zhì)粒DNA的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，梯度

17、液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。（二） 純化方法評價PC（P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫）抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方 法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品（雜質(zhì)為蛋白質(zhì)），該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次PC抽提都會損失一部分核酸（因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫。?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一

18、個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與 蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核 酸，尤其是基因組 DNA造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是 會部分打斷大分子的基因組DNA，但該破壞作用不會強(qiáng)烈到DNA變成10kb以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組DNA的片段，大部分會大于20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對PCR和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只

19、能來回溫和顛倒混勻-此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因?yàn)楸椒?去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹 底去除，以及基因組 DNA會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC抽提的另外一個用途是， 利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點(diǎn)，在RNA抽提時獲得 DNA殘留極少的 RNA。不過有 一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用PC抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也

20、是一個非常不錯的方法。與PC抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了PC抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度（蛋白質(zhì)殘留）不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4C會更好一些。介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶?，純度的穩(wěn)定性很高（雖然純度不一定比 PC純化方法更高）。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即 介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 （如Glassmilk、磁性小珠等）。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都

21、是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會進(jìn)入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力（不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留）。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其 它雜質(zhì)-主要是鹽的分離。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的 醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，

22、單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核 酸沉淀下來（當(dāng)然，得率可能會降低）。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題-主要是純度問題時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。最有參考價值的是的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是 其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠?提高純度。2）沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇

23、沉淀的核酸 比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，少量核酸用異丙醇沉淀，大量 核酸用乙醇沉淀。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我們沒有碰到過，我更覺 得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來， 一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。當(dāng)然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還 有包括PEGLiCkCTAB都可以用于核酸沉淀， 雖然它們

24、遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl可以沉淀RNA以去除DNA, CTAB可以從含多糖的裂解體系中 將核酸沉淀下來。PEG是沉淀病毒顆粒的方便手段。3）沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使 | 用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。（四）核酸的洗滌1）洗滌原理與目的：洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時（使核酸沉淀最終蓬松）；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。大部分資料中的操 作

25、基本上都是 倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一說法，對于質(zhì)量好的離心管，如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好 的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的 掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。避免液體殘余的一個好方法，就是 倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。還有需大家牢記的是，殘液中都含有 上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的 是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。 這步，切忌用手甩，這樣容易將核酸甩掉。 另外， 核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂

26、解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然， 乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的75%乙醇。（五）核酸的溶解和保存1） 核酸溶解：純化后的核酸，其中RNA以水溶解為主，DNA則多以弱堿性的 Tris 或者TE溶解。經(jīng)典的 DNA溶解方法多提倡使用TE溶解，其中原因是有人認(rèn)為EDTA可以減少 DNA被可能殘留下來的DNase降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用Tris或者水（pH接近7）溶解DNA。2） 核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-

27、20C或70C保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降 解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的pH值不合適導(dǎo)致的水解 （RNA在弱酸性更穩(wěn)定，而DNA在弱堿性更合適）。還有一個不為人重視的，就是 EP管對核酸的影響。首先一定要堅信一點(diǎn)，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn) 象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了 。在低濃度的核 酸中加入Geleti n, Glycoge n,BSA可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明，但許多實(shí)

28、驗(yàn)人員并沒 有將該建議當(dāng)回事?，F(xiàn)在制造EP管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強(qiáng)度、 透明度等物理特征方面可能比原來的純PP材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹。 正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種 帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc、multimeric forms of cc 等等帶型。（六）核酸的濃縮應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。 在中等濃度單價陽離子存在下， 加入一定量的 乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收

29、。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。核酸濃縮的具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中1530min，取出目測平衡，04度，12000g ,離心10min。吸棄上清，再另 70%乙醇0.51ml, 12000g, 04度洗滌離心 2min。 吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。單價陽離 子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T,多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀 RNA時，常用LiC，因LiCI在乙醇中溶解度很

30、高，不隨核酸共沉淀。 含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCI，這時該去垢劑要 70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。六、核酸質(zhì)量的檢測問題 將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)， 是唯一可靠的檢測方法； 除此之外的檢測方法， 都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電 泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太 小或者太大 （超出電泳分離范圍 ），該方法還是非常可信的； 電泳還可以用于估計核酸 的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是 同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。紫外分光光度儀

31、檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光 度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可 信。一般講，同時進(jìn)行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判 斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié) 果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。 關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固 定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始（沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真，其中 280、320、230、260nm 下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶 液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。 ）

32、。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；最后， 要記住讀數(shù) A230 ：A260 ：A280 = 1 ：2 （DNA 為 1.8） ：1 為理論上的數(shù)據(jù)，實(shí)際 測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 2 就是純的，如果 A260/A280 2 就是核酸降解。 A260/A230 如果比 2.0 大許多， 一定是有雜質(zhì)殘留的 （具體是什么雜質(zhì)我不知道 ）。如果核酸抽提好后立 即就測定， A260/A280 2.0 決不提示核酸降解， 原因是：那些能導(dǎo)致 A260/A280 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你

33、儀 器提供的 A260/A280 實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值， 在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280 則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂 的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特點(diǎn)，不難得出如下結(jié)論： A230 和 A260 的讀 數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。關(guān)于電泳檢測，觀察瓊脂凝膠中 DNA 的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染 色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入 DNA 的堆積堿基之間的一個平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固 定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與 DNA 結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游

34、 離染料溶液有所增加。 DNA 吸收 254nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染 料本身則在 302nm 和 366nm 有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜 紅橙區(qū)的 590nm 處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測 到少量的 DNA。建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能 用 （如降解太厲害 ），以及核酸的大致濃度， 這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一 個參考 （降解的不必要測了，要測的該取多少量等）。七、核酸中雜質(zhì)的去除 對于一些對核酸純度要求較高的實(shí)驗(yàn)， 我們就需要對其進(jìn)行特殊的處理， 除去其中的 多糖、蛋

35、白質(zhì)及非目的核酸，其方法如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常 在提取液中殘存下來。除去的方法常有： 取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先 使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細(xì)胞內(nèi)肝糖元大大減少。加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。在濃磷酸鹽存在下，以 2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液， 使多糖溶于下層水相， 核酸在上面有機(jī)層中。 以鈣鹽沉淀 DNA ， 再以草酸鉀處理， 使之形成 DNA 鉀鹽回收， 然后用離子交換法吸附 DNA ，使之與多 糖分離。（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細(xì)胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方 法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化 不可避免的步驟。常用方法有下列幾種： 加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分 離純化各階段均可反復(fù)使用此法。 去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用， 效果更加理想。 氯仿 -戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下， DNA 或 RNA 都可以進(jìn)入水相， 蛋白質(zhì)則沉淀于酚層， 然后取水相加入乙醇或 2-乙氧基乙醇沉淀