第12章核酸與核苷類藥物

1、第12章核酸與核苷類藥物1998年4月，大連珍奧核酸科技發(fā)展有限公司在大連開發(fā)區(qū)建成一期工程。珍奧核酸說明書摘錄增強(qiáng)基因自我修復(fù)能力，顯著改善腦機(jī)能，促進(jìn)新陳代謝及細(xì)胞分裂，提高免疫力，美容養(yǎng)顏潤(rùn)膚。核酸具有抗病毒，抑腫瘤，抗衰老，健腦益智的功效。在臨床實(shí)驗(yàn)中，令醫(yī)學(xué)界 十分驚奇的是：在糖尿病及并發(fā)癥，肝臟疾病，高脂血癥，腦血栓后遺癥等心腦血管疾病， 老年癡呆癥，肢體震顫麻痹（帕金森氏?。?，關(guān)節(jié)炎，白細(xì)胞減少癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，性功能減退，肝腎受損等諸多方面，核酸都顯現(xiàn)出獨(dú)特的保健功效。方舟子：核酸營(yíng)養(yǎng)是個(gè)商業(yè)大騙局 ”中國(guó) 人類基因組計(jì)劃”項(xiàng)目負(fù)責(zé)人楊煥明：所謂核酸食品在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上和米粉沒有太

2、大的差別”州理工學(xué)院院長(zhǎng)戴維 巴爾的摩（1975年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）：據(jù)我所知，沒有證據(jù)表明核酸是 一種營(yíng)養(yǎng)物或有益健康。在我看來它不可能有任何益處?！钡谝还?jié)概述一、基本概念核酸與核苷類藥物是指具有藥用價(jià)值的核酸、核苷酸、核苷或者堿基天然的、類似物、衍生物及其聚合物作用：影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝用途：放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、 病毒病核酸是一種多聚體大分子，它的組成單元是核苷酸， 將核苷酸中的磷酸基團(tuán)去掉，剩余部分稱核苷，核苷進(jìn)一步分解可生成戊糖和堿基。L戊糖核橢或脫氣核襯）嘌呤核苷酸AMPF gmp嘧啶

3、核苷酸的結(jié)構(gòu)VIW瑟MP審核酸類藥物分類具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、Col(NAD+) 、Coll(NADP+)。這類藥物有助于改善物質(zhì)代謝和能量平衡，修復(fù)受損組織，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能。臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小， 它們的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。ATP :用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動(dòng)脈或冠狀動(dòng)脈硬化、肝炎等的治療或輔助治 療。肌苷：用于急慢性肝炎、肝硬化、白細(xì)胞減

4、少、血小板減少等。核酸類藥物分類自然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)的類似物和聚合物它們是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥 物。主要有疊氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等?；蛘卟捎没瘜W(xué)一酶合成它們大部分通過由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)進(jìn)行半合成為結(jié)構(gòu)改造物,法。3三氟代胸苷CH疊氮胸苷3苷i無環(huán)鳥苷OH5'-碘脫氧尿雙脫氧肌苷二、核苷酸的生產(chǎn)方法(一)酶解法及堿水解法制備核苷酸1酶解法制備脫氧核苷酸：桔青霉產(chǎn)生5'-磷酸二脂酶；紅酵母產(chǎn)生3'-磷酸二脂酶祜育褥戦煽曲聲1-1 墅酵誰:!T -1圧（*陳障缽 r -M-:1'uk.bJflCfT

5、ft*u+ tw PH脫恒胸TF槪-（cLMP>脫樞胸昔酸fdIMPJ脫就同昔槪（dGMP）2、酶解法制備戊糖核苷酸 我國(guó)從60年代開始使用核酸酶 P1降解核糖核酸生產(chǎn)單核苷酸,苷酸和鳥苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。 酶解法生產(chǎn)5 艸核苷酸工藝流程日本年產(chǎn)呈味核苷酸（肌情育 MB43 諭養(yǎng) 坐杈酸 P,RMAJF *申呼UMFTJJVIP陽菖予褲膽芬痢*I- OGMP. CMPCMP1 - * -AMP I亠 ;襁落催|PH4隱出褲陰痕于捕尙1U根俺OMPWMJ7L 瞳干輸1 UMPliGMf jOMPi1 ANfFl1干帕11干粉丨干粉I慮”干Mb.歿嬲泰鳥選胛，一E

6、SEA解液a-U ii.3、雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥苷酸（I + G）呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商品名簡(jiǎn)稱為（I + G）,用核酸酶 Pl降解RNA可獲得GMP和AMP，其中AMP經(jīng)脫氨生成IMP。雙酶法生產(chǎn)（I十G）工藝。+SW« M843 堵養(yǎng)產(chǎn)生核figg» P* Jj._曰沁 3Wph WarRhJA諒喬|也 入m藥聲韻齡說”山刖“,加 " 1 2n T7、lj4 菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5'-核苷酸。在國(guó)內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn) 5 -核苷酸。（1）菌體自溶法生產(chǎn)核莆酸工藝流程：鬲就祓宏

7、祐頑 Q睡苗體霽函審白涪閩- 麗“応因熏斟強(qiáng) ,：K pH4.5 5.0離心處樸體兩蒔v 陰豐t瓷r氣草夜弄複純此液卜叱【濃編潤(rùn)蘭泌廂靄章孩廿観I pFLl 節(jié)+）" m b It5堿水解法生產(chǎn)2/, 3/ -混合核苷酸RNA結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對(duì)于堿性條件不穩(wěn)定，很容易生成2', 3-環(huán)狀磷酸酯，此環(huán)狀磷酸酯對(duì)堿更不穩(wěn)定，很易加水分解生成 2 /, 3/ -混合核苷酸。取RNA配成3 %3.5%的水溶液，加氫氧化鈉達(dá) 0.3mol / L濃度，升溫至38C,保溫1620小時(shí)，用6mol / L鹽 酸中和至pH7.0,從RNA水解成2' , 3/ -核苷酸的降解率達(dá) 9

8、5 %以上，將2' , 3 / -混合 核苷酸制成每片含 50100mg的片劑，經(jīng)臨床使用，對(duì)非特異性血小板減少癥、對(duì)白血球 減少OHX2Ain* *皿GTPL 0DP * P;GMP(IMP)（三）半合成法制備核苷酸由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下 加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化，從核苷生成5 '-核苷酸收率可達(dá) 90%。例一：肌苷2mmol / L懸浮于5ml磷酸三乙酯中，溫度控制0 °C,添加氯化氧磷6mmol / L , 水2mmol/L,反應(yīng)2h, 5Z -IMP摩爾產(chǎn)率達(dá)91%。例二：鳥苷2mmol / L懸浮于5m

9、l磷酸三甲酯中，溫度控制0 C,添加氯化氧磷6mmol/ L , 水2mmo/L，反應(yīng)6h, 5Z -GMP摩爾產(chǎn)率達(dá) 90%。第二節(jié)核酸類物質(zhì)的生產(chǎn)RNA的提取與制備1. RNA的工業(yè)來源從微生物中提取 RNA，是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法，一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細(xì)菌中 RNA占5% -25 %,在酵母中占2.7%15%,在霉菌中占0.7%28%,面包酵母含RNA4.1 %7.2%。2. 高RNA含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA?？梢詮淖匀唤绾Y選并可用誘變育種的方法提高酵母的RNA含量。發(fā)酵法生產(chǎn)高含量 RNA酵母及其RNA提取工藝流程見圖護(hù)和丁出斤齊斗勿不

10、中廣-空件護(hù)丄洱宰幻RZA廠-羽釦丨 l"fe 花 £12.RNA提取實(shí)例沖灑酵參II 心0P 以下* #*3Omin仝仝j液pH7, O IKjppSm in離心RNAIH體6hkj1/L HG1 _pH2. 5, 1DP以下.放置過夜二、DNA的提取與制備DNA ,可以促進(jìn)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)新陳代謝，延緩機(jī)體衰老，維護(hù)正常免疫功能有積極的 作用。1. 工業(yè)用DNA的提取從冷凍魚精中提取。 魚精中主要含有核蛋白、 酶類以及多種微量元素。 核蛋白的主要成分是脫氧核糖核酸（DNA）和堿性蛋白質(zhì)（魚精蛋白），其中DNA占大約2/3。冷琢色稱上込_色郴勻漿盤訂 心辛“葉，止 右茹2

11、5 *C肉心-童T維狀DAM沉淀派壓低溫噌葉沖伽2. 具有生物活性 DNA的制備 動(dòng)物內(nèi)臟加 4倍量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎 1分鐘，勻漿于 2500rpm 離心 30分鐘，沉淀 用同樣體積的生理鹽水洗滌 3 次，每次洗滌后離心， 將沉淀懸浮于 20 倍量的冷生理鹽水中， 再搗碎3分鐘，加入2倍量5 %十二烷基磺酸鈉，并攪拌 23小時(shí)，在0 C 2500rpm離心， 在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀 DNA ，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓 低溫干燥得粗品 DNA 。三、核苷類藥物的制備核苷是多種核苷類藥物的原料， 這些藥物通常是生物自身能夠合成的組成遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類 似物，目前已用

12、于臨床的此類藥物有幾十種另外， 核苷的發(fā)酵法生產(chǎn)水平大大高于同類結(jié)構(gòu)核苷酸的發(fā)酵水平，因此肌苷酸鈉， 鳥苷酸鈉可分別由肌苷和鳥苷經(jīng)化學(xué)磷酸化方法合成， ATP 由腺苷酯法合成。發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。 用發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有著許多共同特點(diǎn)： 它們都使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌為誘變出發(fā)菌株； 它們都是通過使用物理或化學(xué)誘變方法選育出在遺傳性狀上具有特定標(biāo)記的誘變菌； 它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)時(shí)必須提供限量的生長(zhǎng)因素，并且好氧， 在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。在右邊的合成途徑中，嘌呤核苷酸生物合成的第一個(gè)酶 PRPP 轉(zhuǎn)

13、酰胺酶受 AMP 、ADP 、以 及腺嘌呤衍生物的強(qiáng)烈抑制而受鳥嘌呤衍生物的抑制很弱。 IMP 脫氫酶受最終產(chǎn)物 GMP 及 鳥嘌呤衍生物反饋抑制， SAMP 合成酶受 AMP 反饋抑制的?？莶輻U菌的腺嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時(shí)就累積肌苷。 而枯草桿菌的腺嘌呤、黃嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量鳥嘌呤時(shí)就累積腺苷。PRPPPRPP生產(chǎn)菌株：（1 ）酶6、7缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累 IMP-肌苷（肝炎輔助藥）；（2 ）酶4缺失（為鳥嘌呤缺陷型）積累 XMP-黃苷；（3）酶5缺失積累鳥苷。對(duì)5 ' -IMP的生物合成來說，關(guān)鍵的酶是PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶，利用 產(chǎn)氨短桿菌直接發(fā)酵法生

14、產(chǎn)肌苷酸的關(guān)鍵： 使用腺嘌呤缺陷型菌株。 提供亞適量腺嘌呤從而解除了對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性影響。 選育Mn2+不敏感性變異株 菌本身的5 '-核苷酸降解酶活力低（一）發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或lou）肌苷生產(chǎn)菌（AJ11102）遺傳性狀： 腺嘌呤缺陷型（A-）； GMP還原酶缺失（GMPred-）； 磺胺脒抗性（SGr）； 精氨酸缺陷型（Arg-）。選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率達(dá)20g/L.發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（1）肌苷生產(chǎn)工藝（2 ）發(fā)酵工藝條件：碳源為葡萄糖 保證充足的氮源磷酸鹽的影響Mg+、Ca+有促進(jìn)作用生長(zhǎng)因子腺嘌呤或酵母粉要亞適量最適發(fā)酵溫度為 30-34 C,

15、 pH6.0 6.2需大風(fēng)量，高溶氧和低CO2!-級(jí)種子）歯株變異軸桿加齬獅沖.啟.討蟲種子鱗液1&種子【發(fā)酵衛(wèi)逆些二子培養(yǎng)液肌發(fā)瞬_發(fā)醉就pHb.445, 32± IT, 75hpH7.0, 32 +It.射h32+ 11：, 75h【擴(kuò)大發(fā)酵提取I洗脫毆舸pin.O, 32土代，83hpH23pH3發(fā)酵液？門樹脂吸附物+覽脫帳丁陰活性炭甘，撫滌【撓脫濃縮，緒晶構(gòu)制貓物孕務(wù)翳洗脫液叫執(zhí)豐 M吶70-8012 70-80T卩H】成&加熱，抽獄掙卻(二)聚肌胞苷酸(聚肌胞)(Poyi no si nic , Polycytidylic Acid , Polyl : C)

16、1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1967年美國(guó)人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞是干擾素誘導(dǎo)物，而且具有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶于0.85%氯化鈉溶液。2、生產(chǎn)工藝70年代中期我國(guó)開始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下：1) 底物5-核苷二磷酸吡啶鹽的制備2) 固定化多核苷酸磷酸化酶的制備覺酸粧分步鹽折DEAE“奸維累層析 (1)酶的制備：培養(yǎng)大腸桿菌L683取得菌體收集0.35mol/L NK1洗脫液中酶活最高的部分。固相載體的制備：瓊脂粉熔化固相載體。攪胖越刼后旨環(huán)氧亀丙怕交聯(lián)制嚨球狀 料$-靦酸酯乙楓墓華胺 融業(yè)NaNQ + HCI事貳化-1 J .“(3)固定化多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰浴中的載體，得到共價(jià)結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。3) Poly I : C 制備(1)底物預(yù)處理：CDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽