12基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四個(gè)步驟基因工程基本操作的四個(gè)步驟目的基因的目的基因的獲取獲取基因表達(dá)載體的基因表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)雽?dǎo)入受體細(xì)胞受體細(xì)胞目的基因的目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取基因文庫(kù)基因文庫(kù): : 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段片段, ,導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌的群體的群體中儲(chǔ)存中儲(chǔ)存, ,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因因, ,稱(chēng)為基因文庫(kù)稱(chēng)為基因文庫(kù)(gene library)(gene library)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù): : 基因文庫(kù)中包含了一

2、種基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因生物所有的基因, ,這種基因文庫(kù)這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)叫做基因組文庫(kù). .部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù): : 基因文庫(kù)中包含了一種生物的基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因一部分基因, ,這種基因文這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù)庫(kù)叫做部分基因文庫(kù). .基因組基因組文庫(kù)與文庫(kù)與部分基部分基因文庫(kù)因文庫(kù)的關(guān)系的關(guān)系DUCK179制作基因文庫(kù)的構(gòu)建模式圖基因文庫(kù)的構(gòu)建模式圖通過(guò)對(duì)受通過(guò)對(duì)受體菌的培體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存養(yǎng)而儲(chǔ)存基因基因DUCK179制作依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色

3、體上的位置基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù)文庫(kù))比較比較 概念：概念：PCRPCR全稱(chēng)為全稱(chēng)為_(kāi)，是在生物，是在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ (_ (做啟動(dòng)子做啟動(dòng)子) )、 _ _ 等等 前提條件：前提條件： 。原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNA

4、DNA復(fù)制復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增4 4、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因目的基因雙鏈的解開(kāi)雙鏈的解開(kāi)過(guò)程：過(guò)程：a a、DNADNA變性（變性（90-9690-96）：）：雙鏈雙鏈DNADNA模板在熱作用下，模板在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（復(fù)性、退火（復(fù)性55-6055-60）：）：系統(tǒng)溫度降低，引物與系統(tǒng)溫度降低，引物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合

5、，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：）：在在TaqTaq酶的作用下，從引物的酶的作用下，從引物的55端端33端延伸，合成端延伸，合成與模板互補(bǔ)的與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.1.用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。3.3.將切下的目的基因片段插入將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的質(zhì)粒的_處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個(gè)重，形成了一個(gè)重組組DNA

6、DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 核心核心限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶處理限制酶處理同一種同一種4.4.過(guò)程過(guò)程: :5.5.基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子

7、：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，能終止片斷，能終止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)出來(lái)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法

8、三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化： 目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持內(nèi)維持_和和_的過(guò)程。的過(guò)程。方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1 1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法農(nóng)桿菌介紹農(nóng)桿菌介紹:Ti質(zhì)粒上有質(zhì)粒上有T-D

9、NA,稱(chēng)為可轉(zhuǎn)移的稱(chēng)為可轉(zhuǎn)移的DNA,它可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)它可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞胞,并整合到受體細(xì)并整合到受體細(xì)胞染色體胞染色體DNA上上.2 2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物用用Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)

10、胞混合 感受感受態(tài)態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNA分子分子檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等過(guò)程過(guò)程:A.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針C.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出

11、雜交帶若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中方法方法: : DNADNA分子雜交分子雜交方法方法: : 分分 子子 雜雜 交交方法方法: : 抗原抗體雜交抗原抗體雜交過(guò)程過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜若出現(xiàn)雜交帶交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了Mrna.四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分子的單分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列

12、，鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。的單鏈。 1）以下說(shuō)法正確的是）以下說(shuō)法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控

13、制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C C2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性?xún)?nèi)切酶用于目的基因的獲得限制性?xún)?nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性?xún)?nèi)切酶人工合成目的基因不用限制性?xún)?nèi)切酶4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供