(種的分類的百分比)瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其ITS

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2008,41(12: 4077-4084Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.12.018 瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其ITS序列差異性分析鄭雪芳,藍(lán)江林,曹 宜,肖榮鳳,葛慈斌,劉 波(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所,福州 350003摘要:【目的】鑒定福建省幾種重要瓜類作物枯萎病菌,比較和分析它們的ITS序列差異和種內(nèi)群體分化狀況?！痉椒ā客ㄟ^(guò)分子鑒定結(jié)合形態(tài)鑒定,確定瓜類作物枯萎病菌的種類;通過(guò)它們的ITS序列親緣關(guān)系和多重比較分析,分析該病原菌種內(nèi)群體分化特點(diǎn)?！窘Y(jié)果】供試

2、的26個(gè)菌株屬于兩種鐮孢菌:尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum和串珠鐮孢(Fusarium moniliforme,其中F.oxysporum占54%,為優(yōu)勢(shì)種;這兩種類型菌株的ITS序列差異較大,且主要表現(xiàn)在ITS2區(qū)間,差異達(dá)20.4%,而ITS1區(qū)間的序列完全相同或只有1個(gè)堿基的差異;F.oxysporum種內(nèi)存在3類ITS序列,類型I與類型在376 bp處有1個(gè)堿基(C/T的差異,類型比類型少1個(gè)堿基(A;F.moniliforme種內(nèi)也存在3類,類型與類型在320 bp處有1個(gè)堿基差異(T/C,類型與類型有3個(gè)堿基的差異,分別是在38 bp處有1個(gè)堿基差異(A/C,在39

3、5 bp處有1個(gè)堿基差異(T/C,在429 bp處有1個(gè)堿基的差異(T/A。【結(jié)論】福建省瓜類作物枯萎病菌為F.oxysporum和F.moniliforme。這兩種鐮孢菌種間的ITS序列差異較大且主要差異在ITS2區(qū)間,但是這兩種類型鐮孢菌種內(nèi)ITS序列差異卻很小。關(guān)鍵詞:瓜類作物;鐮孢菌;鑒定;ITS序列Identification and ITS Sequence Analysis of Fusarium WiltPathogens from the Cucurbits CropsZHENG Xue-fang, LAN Jiang-lin, CAO Yi, XIAO Rong-feng,

4、 GE Ci-bin, LIU Bo (Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003Abastract: 【Objective】 The fusarium wilt pathogens of cucumber, melon, watermelon and bottle gourd in Fujian Province were identified and their ITS-rDNA sequences were analyzed. 【Me

5、thod】With the molecular identification and morphological characteristic, the species of pathogens were distinguished. By means of the genetic relationship analysis and multiple comparison analysis of ITS sequences of pathogens, the diversity of intra-species in the pathogens were investigated. 【Resu

6、lts】 Twenty-six strains were analyzed to class into two different species, e.g. Fusarium oxysporum and Fusarium moniliforme. F.oxysporum was the dominant species, accounted for 54% in the tested strains. The differences of ITS sequences between the two species were significant and mainly lay in ITS2

7、 with the difference accounted to 20.4% in them, in comparison to ITS1 sequences they were absolutely identical or one base difference. F. oxysporum strains had three types according to ITS sequences, type I and type were similar with one base difference at the position of 376nt (C/T, type had one b

8、ase deletion at the position of 103nt compared to type ; F. moniliforme strains also had three types, type I and typehad one base difference at the position of 320nt (T/C, there were 3 base difference between type I and type : 38th position (A/C, 395th position (T/C and 429th position (T/A. 【Conclus

9、ion】 The fusarium wilt pathogens from cucumber, melon,watermelon and bottle gourd in Fujian are Fusarium oxysporum and Fusarium moniliforme. The differences of ITS sequences between F. oxysporum and F. moniliforme are obvious and mainly lay in ITS2, however, there are little differences of ITS seque

10、nces among intra-species.Key words: Cucurbits crops; Fusarium; Identification; ITS sequence analysis收稿日期:2007-11-23;接受日期:2008-01-29基金項(xiàng)目:國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10A211;福建省自然基金(2006J0068;省財(cái)政專項(xiàng)-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金(STIF-Y03作者簡(jiǎn)介:鄭雪芳(1977-,女,福建莆田人,碩士,研究方向?yàn)樯锓乐窝芯俊el:130*;E-mail:zhengxuefang2003。通訊作者劉波(1957-,男,福建

11、惠安人,研究員,博士,研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)和生物農(nóng)藥研究。Tel:139*;E-mail:fzliubo4078 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 41卷0 引言【研究意義】瓜類作物枯萎病是由致病性鐮孢菌侵染引起的,是瓜類作物生產(chǎn)中的重大病害之一1。由于致病性鐮孢菌菌株存在形態(tài)、生理、病理等的多態(tài)性和復(fù)雜性,因此,對(duì)枯萎病病原菌進(jìn)行分類鑒定及其差異性分析具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的病原真菌的分類和鑒定主要基于形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、致病性測(cè)定等,如黃仲生2根據(jù)黃瓜枯萎病病原菌的形態(tài)特征和致病性測(cè)定,確定黃瓜枯萎病致病菌為尖孢鐮孢黃瓜專化型。任海英等3通過(guò)對(duì)分離菌株的培養(yǎng)性狀、孢子形態(tài)等生物學(xué)性狀

12、觀察,確定蠶豆枯萎病病原菌主要是尖鐮孢、木賊鐮孢、串珠鐮孢和燕麥鐮孢。但由于真菌種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜,對(duì)未知菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定往往是專業(yè)真菌學(xué)家的工作。另外,由于真菌的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)易隨環(huán)境條件的變化而表現(xiàn)不穩(wěn)定。因此,傳統(tǒng)的真菌分類和鑒定方法常使人們產(chǎn)生意見分歧4?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于傳統(tǒng)的病原真菌分類和鑒定的局限性,克隆和測(cè)序真菌核糖體基因,根據(jù)其基因序列的差異進(jìn)行真菌菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究已成為植物病原學(xué)的研究熱點(diǎn)5-7?！緮M解決關(guān)鍵問(wèn)題】本研究是在傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上,利用核糖體DNA-ITS 區(qū)序列來(lái)輔助鑒定不同瓜類寄主作物上分離的枯萎病菌類型及種群劃分。1 材料與

13、方法1.1 供試菌株26株分離自不同瓜類寄主作物(黃瓜、甜瓜、西瓜和瓠瓜的單孢菌株,經(jīng)培養(yǎng)菌落、分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子等的形態(tài)特征觀察,初步鑒定為尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum 和串珠鐮孢(Fusarium moniliforme ,其中部分菌株為前期試驗(yàn)中已經(jīng)鑒定的?；?表1。表1 供試鐮孢菌菌株Table 1 The tested Fusarium strains序號(hào) No 寄主 Host菌株 Strain地點(diǎn)Location專化型Specialized form致病性 Pathogenicity 1 F-H.6.5-030318-02 漳州昭安 Zhangzho

14、u zhaoan 尖孢鐮孢菌黃瓜專化型 F.oxysporum f. sp . cucumerinum 致病Pathogenic 2 Fm-H.6.5-030318-04漳州昭安 Zhangzhou zhaoan 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 3 F-H.6.5-030318-01 漳州昭安 Zhangzhou zhaoan 尖孢鐮孢菌黃瓜專化型 F.oxysporum f. sp . cucumerinum 非致病Nonpathogenic4 Fm-H.6.5-030318-12漳州昭安 Zhangzhou zhaoan 未鑒定 Unchecked 致病Pathoge

15、nic5 Fm-H.6.5-030318-13漳州昭安 Zhangzhou zhaoan 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 6黃瓜 Cucumber Fm-H.6.5-030318-11漳州昭安 Zhangzhou zhaoan 未鑒定 Unchecked致病Pathogenic 7 F-T.1.7-030514-12 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌甜瓜?；?F.oxysporum f. sp . melonis 致病Pathogenic 8 F-T.1.7-030514-21 福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked致病Pa

16、thogenic 9 F-T.1.7-030514-31 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌甜瓜?；?F.oxysporum f. sp . melonis 致病Pathogenic 10Fm-T.1.7-030520 福州永泰 Fuzhou yongtai未鑒定 Unchecked 非致病Nonpathogenic 11 F-T 2.1.1-030616-01 福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 12 F-T 2.1.1-030616-15 福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked 致病Pa

17、thogenic 13 F-T.1.7-040427-1 福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 14甜瓜 Melon Fm-T.1.7-040427-3福州永泰 Fuzhou yongtai未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 15 Fm-X.1.7-030520-02福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked致病Pathogenic 16 F-X.1.7-030520-03 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌西瓜專化型 F.oxysporum f. sp . niveum 致病Pa

18、thogenic 17 Fm-X.1.7-030520-11福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked非致病Nonpathogenic 18 F-X.1.7-030520-12 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌西瓜?；?F.oxysporum f. sp . niveum 致病Pathogenic 19 F-X.1.7-030520-13 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌西瓜?；?F.oxysporum f. sp . niveum 致病Pathogenic 20 Fm-X.1.7-030527-02福州永泰 Fuzhou yon

19、gtai 未鑒定 Unchecked致病Pathogenic 21 F-X.1.7-030527-11 福州永泰 Fuzhou yongtai 尖孢鐮孢菌西瓜?；?F.oxysporum f. sp . niveum 致病Pathogenic 22 F-X.1.7-030527-12 福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 23 Fm-X.1.7-030527-31福州永泰 Fuzhou yongtai 未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 24 西瓜 Watermelon Fm-X.1.7-030527-08福州永泰 F

20、uzhou yongtai未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 25 F-G.1.5-031017-01 福清 Fuqing未鑒定 Unchecked 致病Pathogenic 26瓠瓜 Bottle gourd Fm-G.1.5-031017-05福清 Fuqing 未鑒定 Unchecked致病Pathogenic12期鄭雪芳等:瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其ITS序列差異性分析 40791.2 生化試劑DNA膠回收純化試劑盒、高保真Taqplus DNA 聚合酶均購(gòu)自杭州博日科技有限公司,100 bp plus DNA ladder及其它生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程有

21、限公司或?yàn)閲?guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.3 ITS區(qū)擴(kuò)增CTAB法提取菌株DNA,引物根據(jù)文獻(xiàn)8設(shè)計(jì)合成,正向引物:5-CTTGCGTTGAT TACGTCCC -3,反向引物:5-TCCTCCGCTTATTG ATATGC -3。PCR 反應(yīng)的總體積為25 µl,含有1個(gè)單位的Taq酶、10×buffer 2.5 µl、dNTP 0.2 µl、10 µmol·L-1的正向引物和反向引物各1 µl、DNA模板25 ng。PCR擴(kuò)增程序:94預(yù)變性10 min,94變性1 min,55退火1 min,72延伸2 min,共25個(gè)循環(huán),最

22、后72延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切出目的片段,經(jīng)純化后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物雙向直接測(cè)序。1.4 ITS區(qū)序列分析測(cè)序結(jié)果中每個(gè)樣品的雙向序列用DNAstar軟件中SeqMan進(jìn)行拼接并輸出全序列,將獲得的序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析,用DNAMAN version 5.2.2.0軟件對(duì)26個(gè)菌株的序列進(jìn)行多重比較及聚類分析。2 結(jié)果與分析2.1 鐮孢菌的形態(tài)學(xué)描述2.1.1 尖孢鐮孢 菌株在PSA平板上,25 下培養(yǎng)10 d后,氣生菌絲體為白色棉絮狀,稀疏或濃密;菌落背面呈白色、淺粉色,或紫色

23、。小型分生孢子長(zhǎng)橢圓形或紡錘形,無(wú)色透明,01隔,少數(shù)2個(gè)隔膜,大小10.4(2.619.5×3.0(2.03.9µm;大型分生孢子鐮刀型或紡錘型,稍彎,足胞明顯,14個(gè)隔膜,多為3個(gè)隔膜,大小29.9(15.649.4×3.4(2.3 5.2µm(圖1-a;厚垣孢子頂生或串生,圓形或長(zhǎng)圓形,12.1(6.526.0µm×7.9(5.211.7µm(圖 a:小型分生孢子和大型分生孢子;b:厚垣孢子;c:產(chǎn)孢細(xì)胞a; Microconidia and macroconidia; b: Chlamydospore; c: Con

24、idiogenous spore圖1尖孢鐮孢的形態(tài)特征Fig. 1 Morphology of Fusarium oxysporum1-b;產(chǎn)孢細(xì)胞短,單瓶梗(圖1-c。2.1.2 串珠鐮孢 菌株在PSA平板上,25下培養(yǎng)10 d后,氣生菌絲體絨狀至粉狀,稀疏或濃密;菌落背面呈白色、米黃色,或紫色。小型分生孢子長(zhǎng)橢圓形或紡錘形,無(wú)色透明,01隔,大小7.3(2.010.5µm×3.0(1.34.5µm;大型分生孢子鐮刀型或紡錘型,較直細(xì),足胞不明顯,15個(gè)隔膜,其中3個(gè)隔膜的居多,大小為33.8(28.639.0µm×3.3(2.65.5

25、81;m(圖2-a;厚垣孢子有或無(wú),頂生或串生,圓形或長(zhǎng)圓形,9.9(6.513.0µm×9.6(5.213.0µm(圖2-b;產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶?；驈?fù)瓶梗(圖2-c。2.2 ITS區(qū)擴(kuò)增供試的鐮孢菌菌株的核糖體DNA ITS區(qū)擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示,26株不同寄主、不同?；图安煌虏×Φ溺犳呔甓紨U(kuò)增出單一條帶,大小為700800 bp。2.3 ITS區(qū)序列測(cè)定序列測(cè)定結(jié)果顯示,序列長(zhǎng)度為676691 bp不等,序列中包含部分18 S rRNA、ITS1、5.8 S rRNA、ITS2及部份28 S rRNA,所獲得的26個(gè)菌株的核苷酸序列均已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)

26、中注冊(cè),序列號(hào)為EU364842364867。4080 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)41卷 a:小型分生孢子和大型分生孢子;b:厚垣孢子;c:產(chǎn)孢細(xì)胞a: Microconidia and macroconidia; b. Chlamydospore; c. Conidiogenous cells spore圖2 串珠鐮孢的形態(tài)特征Fig. 2 Morphology of Fusarium moniliforme M:100 bp DNA ladder;泳道編號(hào)126為表1中所列菌株;CK:清水空白對(duì)照M: 100 bp DNA ladder plus; 1-26: Isolates listed in ta

27、ble 1; CK: Negative control圖3 供試菌株的ITS-PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 3 ITS-PCR patterns of the tested strains2.4 測(cè)序結(jié)果與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較將所得序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索。根據(jù)Renske Landeweert等9對(duì)真菌的分子分類原則:即認(rèn)為通過(guò)ITS區(qū)域比對(duì),序列相似性99%,鑒別為相同種;序列相似性大于95%且小于99%,鑒別為相同屬;序列相似性95%,鑒別為相同科。菌株F-H.6.5-030318-02、F-H.6.5-030318-01、F-T.1.7-03

28、0514-12、F-T.1.7-030514-21、F-T.1.7-030514-31、F-T2.1.1-030616-01、F-T2.1.1-030616-15、F-X.1.7-030520-03、F-X.1.7-030520-12、F-X.1.7-030520-13、F-X.1.7-030527-11、F-X.1.7-030527-12、F-T.1.7-040427-1、F-G.1.5-031017-01與尖孢鐮孢(F. oxysporum的同源性最高,達(dá)99%以上,推定這些菌株為尖孢鐮孢;菌株Fm-H.6.5-030318-04、Fm-H.6.5-030318-12、Fm-H.6.5-0

29、30318-13、Fm-H.6.5-030318-11、Fm-T.1.7-030520、Fm-X.1.7-030520-02、Fm-X.1.7-030520-11、Fm-X.1.7-030527-02、Fm-X.1.7-030527-31、Fm-X.1.7-030527-08、Fm-T.1.7-040427-3、Fm-G.1.5- 031017-05與串珠鐮孢(F. moniliforme的同源性最高,達(dá)99%以上,推定這些菌株為串珠鐮孢。2.5 基于ITS區(qū)間序列的聚類分析用DNAMAN version 5.2.2.0軟件對(duì)這26株鐮孢菌的ITS區(qū)序列(包括ITS1、5.8S、ITS2進(jìn)行多

30、重同源性比較,構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(圖4。在同源系數(shù)為92%的條件下,供試的26菌株被劃分為2個(gè)類群:第1類為尖孢鐮孢,共有14株,占54%,代表菌株F-H.6.5-030318-02;第2類為串珠鐮孢,共有12株,占46%,代表菌株Fm-H.6.5-030318-04。另外,第1類群中的尖孢鐮孢各菌株ITS區(qū)間的同源性達(dá)100%,而第2類群的串珠鐮孢,在同源系數(shù)為99%的條件下,又被細(xì)分為2個(gè)類群,菌株Fm-12期鄭雪芳等:瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其ITS序列差異性分析 4081圖4 基于ITS序列的聚類圖Fig. 4 Phylogenetic tree of Fusarium based

31、 on ITS H.6.5-030318-04、Fm-H.6.5-030318-12、Fm-H.6.5- 030318-13、Fm-X.1.7-030520-02和Fm-X.1.7-030527- 31的同源性為100%聚為一類,菌株Fm-H.6.5- 030318-11、Fm-T.1.7-030520、Fm-X.1.7-030520-11、Fm-X.1.7-030527-02、Fm-X.1.7-030527-08、Fm-T.1.7- 040427-3和Fm-G.1.5-031017-05的同源性為100%聚為一類。2.6 尖孢鐮孢和串珠鐮孢ITS序列的差異性分析應(yīng)用DNAMAN versio

32、n 5.2.2.0軟件對(duì)本研究中分離的兩種類型菌株(尖孢鐮孢和串珠鐮孢的ITS1和ITS2分別進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果表明,兩種類型菌株的ITS區(qū)序列差異主要在于ITS2區(qū)間的差異,如圖5所示(圖中陰影部分表示兩類菌株在該位點(diǎn)的差異堿基,兩類型菌株在ITS2區(qū)的序列差異達(dá)20.4%,而它們的ITS1區(qū)間的序列完全相同或有1個(gè)堿基的差異(圖6,ITS2區(qū)的序列差異類型為堿基的置換(其中轉(zhuǎn)換顛換=925和堿基的缺失。2.7 尖孢鐮孢菌株間ITS序列的差異性分析應(yīng)用DNAMAN version 5.2.2.0軟件對(duì)本研究中分離的14株尖孢鐮孢ITS區(qū)序列(包括ITS1、5.8S、ITS2進(jìn)行多重比較分析,

33、結(jié)果顯示,14株尖孢鐮孢ITS區(qū)序列有3種不同的類型,類型I包括黃瓜上1個(gè)菌株F-H.6.5-030318-01(No. 3,甜瓜上2個(gè)菌株F-T2.1.1-030616-01(No. 11和F-T2.1.1-030616-15(No 12,瓠瓜上1個(gè)菌株F-G.1.5-031017-01(No. 25,這4個(gè)菌株ITS序列完全相同;類型包括黃瓜上1 陰影部分表示兩類菌株在該位點(diǎn)的堿基有差異;“.”表示該位點(diǎn)堿基缺失Shadow part showed base difference at the position; “.” showed base deletion at the positi

34、on圖5 尖孢鐮孢和串珠鐮孢的ITS2區(qū)序列比對(duì)Fig. 5 Sequence alignment of the ITS2 of Fusarium oxysporum and Fusarium moniliforme個(gè)菌株F-H.6.5-030318-02(No. 1,甜瓜上2個(gè)菌株F-T.1.7-030514-31(No. 9和F-T.1.7-040427-1(No.13,這3個(gè)菌株ITS序列完全相同;類型包括甜瓜上2個(gè)菌株F-T.1.7-030514-12(No. 7和F-T.1.7- 030514-21(No. 8,西瓜上5個(gè)菌株F-X.1.7-030520-03(No. 16、F-X.

35、1.7-030520-12(No. 18、F-X.1.7-030520-13(No. 19、F-X.1.7-030527-11(No.21和F-X.1.7-030527-12(No. 22,這7個(gè)菌株的ITS序列完全相同。類型I菌株與類型菌株在376 bp 處有1個(gè)堿基(C/T的差異,在103 bp處,類型4082 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 41 卷 圖6 Fig. 6 尖孢鐮孢和串珠鐮孢的 ITS1 區(qū)序列比對(duì) Sequence alignment of the ITS1 of Fusarium oxysporum and Fusarium moniliforme 菌株比類型菌株少 1 個(gè)堿基

36、（A）。 2.8 串珠鐮孢菌株間 ITS 序列的差異性分析 應(yīng)用 DNAMAN version 5.2.2.0 軟件對(duì)本研究中分 離的 12 株串珠鐮孢 ITS 區(qū)序列 （包括 ITS1、 5.8S、 ITS2） 進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果顯示，12 株串珠鐮孢 ITS 區(qū) 序列也有 3 種類型，類型菌株包括黃瓜上 3 個(gè)菌株 Fm-H.6.5-030318-04 （ No.2 ） 、 Fm-H.6.5-030318-12 （No.4）、Fm-H.6.5-030318-13（No.5）和西瓜上 1 個(gè)菌株 Fm-X.1.7-030520-02（No.15），這 4 個(gè)菌株的 ITS 序列完全相同。

37、類型只包括西瓜上 1 個(gè)菌株 Fm-X.1.7-030527-31。類型包括黃瓜上 1 個(gè)菌株 Fm-H.6.5-030318-11 （ No.6 ） ， 甜 瓜 上 2 個(gè) 菌 株 Fm-T.1.7-030520 （ No.10 ） 和 Fm-T.1.7-040427-3 （No.14），西瓜上 3 個(gè)菌株 Fm-X.1.7-030520-11 （No.17） Fm-X.1.7-030527-02 、 （No.20） Fm-X.1.7和 030527-08 No.24） 瓠瓜上 1 個(gè)菌株 Fm-G.1.5-031017 （ ， -05（No.26），這 7 個(gè)菌株的 ITS 序列相同。類型

38、 菌株與類型菌株在 320 bp 處有 1 個(gè)堿基差異 （T/C） ， 類型菌株與類型菌株有 3 個(gè)堿基的差異，分別是 在 38 bp 處有 1 個(gè)堿基差異（A/C），在 395 bp 處有 1 個(gè)堿基差異（T/C），在 429 bp 處有 1 個(gè)堿基的差異 （T/A）。 Fusarium12-14 、 Alternaria15 、 Colletotrichum16-18 、 Phytophthora19-22、 Rhizoctonia23等病原真菌的分類鑒 定 上 。本 研究 中 分離 自不 同 瓜類 作物 的 枯萎 病菌 （Fusarium spp.），經(jīng) ITS 區(qū)序列同源性搜索，發(fā)現(xiàn)

39、它 們 屬 于 鐮 孢 菌 的 2 個(gè) 不 同 種 ： 尖 孢 鐮 孢 （ F. oxysporum）和串珠鐮孢（F. moniliforme）。由于尖孢 鐮孢和串珠鐮孢的菌落及顯微形態(tài)特征相似，如它們 的大型分生孢子都呈鐮刀狀，兩端漸尖，主要區(qū)別在 于串珠鐮孢的大型分生孢子較直細(xì)，而它們的小型分 生孢子都是呈長(zhǎng)橢圓形或紡錘形。另外，尖孢鐮孢一 般有厚垣孢子，而串珠鐮孢有時(shí)不出現(xiàn)厚垣孢子，但 這些差異若不是經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)的專家，很難將它們準(zhǔn)確區(qū) 分。 GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中有鐮孢菌屬許多種 而 的 ITS 序列， 所以可以通過(guò)測(cè)定鐮孢菌 rDNA 基因 ITS 序列，結(jié)合形態(tài)鑒定，這必將使

40、得鐮孢菌的鑒定更為 客觀、準(zhǔn)確。 本研究通過(guò) ITS 區(qū)序列對(duì)瓜類作物枯萎病病原菌 進(jìn)行分類和比較分析， 研究表明， 供試的 26 株不同瓜 類寄主作物的枯萎病病原菌被劃分為 2 大類群，第一 類群為尖孢鐮孢，共有 14 株，占總菌株 54%，說(shuō)明 尖孢鐮孢是瓜類作物枯萎病菌的優(yōu)勢(shì)病原菌，這一結(jié) 果與劉志恒等 24 認(rèn)為尖孢鐮孢是引起瓜類作物枯萎 病成災(zāi)的主要病原菌的結(jié)論是一致的；第二類群為串 珠鐮孢，共有 12 株，占總菌株 46%。對(duì)尖孢鐮孢各 菌株的 ITS 序列以及串珠鐮孢各菌株的 ITS 序列進(jìn)行 的多重比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同專化型的菌株 ITS 區(qū) 序 列 可 以 完 全 相 同

41、（ 如 甜 瓜 專 化 型 菌 株 F-H.6.5030318-J1 和西瓜?；途?F-X.1.7-030520-03） 而 ， 同一?；偷木?ITS 區(qū)序列也有可能存在一定的差 異（如甜瓜專化型的兩個(gè)菌株 F-T.1.7-030514-12 和 F-T.1.7-030514-31 的 ITS 區(qū)序列存在 1 個(gè)堿基的差 異），說(shuō)明 ITS 區(qū)序列無(wú)法用于區(qū)分菌株的專化型。 這一結(jié)論與余仲東等25認(rèn)為 ITS 區(qū)序列不適合種下階 3 討論 鐮孢菌的分類鑒定是一項(xiàng)十分復(fù)雜的工作，傳統(tǒng) 的鐮孢菌分類鑒定主要是以形態(tài)特征和生理生化指標(biāo) 作為該病原真菌分類鑒定的主要依據(jù)，但此方法受多 種外界因

42、素的影響，具有很大的不確定性，特別是有 時(shí)培養(yǎng)物不典型或不產(chǎn)孢，使得鑒定工作更困難 10 。 因此，根據(jù) DNA 水平的差異進(jìn)行真菌的鑒定或系統(tǒng) 發(fā)育的研究越來(lái)越得到重視。人們發(fā)現(xiàn) ITS 區(qū)具有豐 富變異特點(diǎn)，常常將這一可變區(qū)作為真菌菌種和分離 物鑒定的可靠依據(jù)之一 11 ，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于 12 期 鄭雪芳等：瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其 ITS 序列差異性分析 4083 元?jiǎng)澐值挠^點(diǎn)相吻合。另外，對(duì)本試驗(yàn)中分離的兩種 類型菌株：即串珠鐮孢和尖孢鐮孢的 ITS 區(qū)序列進(jìn)行 比對(duì)分析，結(jié)果表明串珠鐮孢和尖孢鐮孢的 ITS 區(qū)序 列差異主要在于 ITS2 區(qū)間，而 ITS1 區(qū)間序列完全相

43、 同或有 1 個(gè)堿基的差異，因此，可以利用菌株的 ITS2 區(qū)間的序列作為進(jìn)一步研究鐮孢菌種內(nèi)進(jìn)化的一個(gè)判 別指標(biāo)。 7 6 detection and phylogenetic analysis. Fungal Genetics and Biology, 2003, 38: 159-174. Hermosa M R, Grondona I, Iturriaga E A, Diaz-Minguez J M, Castro C, Monte E, Garcia-acha I, Molecular characterization and identification of biocontrol

44、isolates of Trichoderma spp. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(5: 1890-1898. Levy L, Castlebury L A, Carris L M, Meyer R J, Pimentel G. Internal transcribed spacer sequence-based phylogeny and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism differentiation of Tillet

45、ia walkeri and T. indica. Phytopathology, 2001, 91(10: 935-940. 8 楊 紅, 李 穎, 關(guān)國(guó)華, 李秀玉尖孢鐮刀菌異核體及不同核型 4 結(jié)論 本研究采用分子生物學(xué)方法結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定法， 確定福建省瓜類作物枯萎病菌為尖孢鐮孢（Fusarium oxysporum）和串珠鐮孢（Fusarium moniliforme）， 其中 F. oxysporum 占 54%，為優(yōu)勢(shì)種。F. oxysporum 和 F. moniliforme 這兩種鐮孢菌種間的 ITS 序列差異較 大，且主要表現(xiàn)在 ITS2 區(qū)間，差異達(dá) 20.4%，但是這

46、兩種鐮孢菌種內(nèi)的 ITS 序列完全相同或只有 13 堿基 的差異，說(shuō)明 ITS 區(qū)序列在屬內(nèi)種間差異鑒別具有一 定的參考價(jià)值，但不適合種內(nèi)或種下階元的鑒定和分 類。 References 1 郝曉娟, 劉 波, 謝關(guān)林. 植物枯萎病生物防治研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng) 學(xué)通報(bào), 2005, 21(7: 319-322. Hao X J, Liu B, Xie G L. Research progress in biological control of Fusarium wilt disease. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005, 21(7: 31

47、9-322. (in Chinese 2 黃仲生, 楊玉茹. 黃瓜枯萎病病原菌鑒定及防治研究. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 1990, 5(4: 99-104. Huang Z S, Yang Y R. Studies on the cucumber Fusarium wilt pathogen and its control. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 1990, 5(4:99-104. (in Chinese 3 任海英, 陳志誼, 許志剛, 陸金元, 徐永昌. 常熟地區(qū)蠶豆枯萎病 病原菌鑒定及其致病力初探. 植物保護(hù), 2003, 29(4: 30-32. R

48、en H Y, Chen Z Y, Xu Z G, Lu J Y, Xu Y C. Study on main species and virulence of faba bean Fusarium wilt in Changshu Aera. Plant Protection, 2003, 29(4: 30-32. (in Chinese. 4 匡治州, 許 楊. 核糖體 rDNA ITS 序列在真菌學(xué)研究中的應(yīng)用. 分離子 rDNA ITS 區(qū)序列分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2002, 10(4: 381-384. Yan H, Li Y, Guan G H, Li X Y. Sequen

49、cing of ITS region in rRNA gene of a heterokaryon and its segregants of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Journal of Agricultural Biotechnology, 2002, 10(4: 381-384. (in Chinese 9 Renske L, Paula L, Thomw K. Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons. Applied and Envi

50、ronmental Microbiology, 2003, 69(1: 327-333. 10 李多川, 沈崇堯. 系統(tǒng)聚類分析在鐮刀菌鑒定中的應(yīng)用. 微生物學(xué) 通報(bào), 1993, 20(6: 323-327. Li D C, Shen C Y. The application of hierachical cluster analysis to identification of the genus Fusarium. Microbiology, 1993, 20(6: 323-327. (in Chinese 11 Schmidt O, Moreth U. Data band of rDN

51、A-ITS sequences from building-rot fungi for their identification. Wood Science and Technology, 2002, 36: 429-433. 12 Ninet B, Jan I, Bontems O, Lechenne B, Jousson O, Lew D, Schrenzel J, Panizzon R G, Monod M. Molecular identification of Fusarium species in Onychomycoses. Dermatology, 2005, 210: 21-

52、25. 13 Lievens B, Claes L, Vakalounakis D J, Vanachter A C R C, Thomma B P H J. A robust identification and detection assay to discriminate the cucumber pathogens Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum and f. sp. radicis-cucumerinum. Environmental Microbiology, 2007, 9(9: 2145-2161. 14 Vakalounakis D

53、 J, Fragkiadakis G A. Genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates from cucumber: differentiation by pathogenicity, vegetative compatibility, and RAPD fingerprinting. Phytopathology, 1999, 89(2: 161-168. 15 Pryor B M, Gilbertson R L. Relationships and taxonomic status of Alternaria radicina, A.

54、carotiincultae, and A. petroselini based upon morphological, biochemical, and molecular characteristics. Mycologia, 生命的化學(xué), 2004, 24(2: 120-122. Kuang Z Z, Xu Y. The application of ribosomal gene rDNA in fungal research. Chemistry of Life, 2004, 24(2: 120-122. (in Chinese 5 Pantou M P, Mavidou A, Typ

55、as M A. IGS sequence variation, group-I introns and the complete nuclear ribosomal DNA of the entomopathogenic fungus Metarhizium: excellent tools for isolate 4084 2002, 94(1: 49-61. 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 41 卷 分類輔助性狀的研究. 菌物系統(tǒng), 2000, 19(4: 485-491. Wang Y C, Zhang Z G, Zheng X B. Use ITS regions of rRNA gene as an additional characteristic in identification of Phytophthora boehmeriae. Mycosystema, 2000, 19(4: 485-491. (in Chinese 23 Liu Z L, Domier L L, Sinclair J B. Polymorphism of Genes coding for nuclear 18S rRNA indicates genetic Disti