復(fù)制大鼠膜性腎小球腎炎伴新月體形成和腎小球硬化模型的研究

1、    復(fù)制大鼠膜性腎小球腎炎伴新月體形成 和腎小球硬化模型的研究        摘要：Sprague-Dawley大鼠預(yù)免疫2周后，采用由腹腔逐漸過(guò)渡至靜脈的方法，每日注射陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)。結(jié)果：靜脈注射C-BSA2周后，熒光顯微鏡觀察顯示IgG沿腎小球毛細(xì)血管壁呈顆粒狀沉積，光鏡下可見(jiàn)有新月體形成，電鏡下可見(jiàn)大量上皮下電子致密沉積物；4周后，上皮下電子致密沉積物融合成大片狀；6周后，較多大鼠出現(xiàn)腎小球硬化。關(guān)鍵詞：膜性腎小球腎炎；新月體；腎小球

2、硬化；大鼠 A Rat Model of Membranous Glomerulonephritis With the Formation of Crescent and Glomerular SclerosisWu Baoyu(武寶玉),Wei Min(魏民),Li Boguang(李伯光),et al.(Department of Internal Medicine, Beijing TongRen Hospital, Beijing 100730, Department of Pathology, Beijing University of Traditional Chinese Med

3、icine, B eijing 100029)ABSTRACT: After two-week preimmunization, Sprague-Dawley rat s were daily i njected with cationized bovine serum albumin (C-BSA) intraperitoneally. It was f ound that, after two-week C-BSA intravenous injection, granular deposits of IgG along glomerular capillary walls was sho

4、wn by fluorescence microscopy, the forma tion of crescent shown by light microscopy and a large amount of subepithelial e lectron-dense deposits shown by electron microscopy; after four weeks, subepithe lial electron-dense de posits fused into large patches; after six weeks, glomerular sclerosis was

5、 found in most rats.KEY WORDS: Membranous glomerulonephritis; Crescent; Glomerular scl erosis; Rat用陽(yáng)離子化抗原復(fù)制的膜性腎小球腎炎動(dòng)物模型，其免疫發(fā)病機(jī)理和人類腎小球腎炎非常近似，是一種較理想的慢性腎小球腎炎病理模型13。牛血清白蛋白是研究血清病最常用的抗原，然而用陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(Cationizedbovineserumalbumin,C-BSA)復(fù)制大鼠慢性血清病性腎炎的報(bào)道并不多，而且極少有新月體形成和腎小球硬化。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用C-BSA復(fù)制慢性血清病模型，并使其產(chǎn)生膜性

6、腎炎病變。1材料與方法1.1抗原制備天然牛血清白蛋白：電泳純，等電點(diǎn)為4.5，上海醫(yī)學(xué)化學(xué)檢驗(yàn)所產(chǎn)品。碳化二亞胺(EDC)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。無(wú)水乙二胺(EDA)：分析純，日本進(jìn)口分裝。參照有關(guān)文獻(xiàn)4，在適宜的反應(yīng)條件(pH4.75，T：25)下，用EDC活化蛋白的羧基，使之為EDA的胺基所置換，提高蛋白的等電點(diǎn)，使之大于9.0，制備出陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)。1.2模型制作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重160200g，北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組：病理組30只，用C-BSA復(fù)制腎炎模型；正常對(duì)照組15只，正常飼養(yǎng)，不作任何處

7、理。預(yù)免疫(致敏免疫)：用C-BSA1mg加弗氏完全佐劑0.5mL作皮下、肌肉多點(diǎn)注射，10d后重復(fù)免疫1次。預(yù)免疫2周后，每日注射C-BSA。先腹腔注射1周，第1日至第7日的劑量依次為2mg、4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg，之后改為尾靜脈注射，共6周。尾靜脈注射第1周第1天至第7天的劑量依次為1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg，此后每天8mg，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。1.3觀察項(xiàng)目1.3.1腎功能檢查：尿蛋白測(cè)定。定性：采用硫柳酸法，于注射C-BSA后隔日檢測(cè)1次。定量：采用比濁法，于注射C-BSA后每周測(cè)定1次24h尿蛋白含量。血清肌酐測(cè)定。于靜脈注射C-B

8、SA2、4、6周后，2組大鼠分別心臟取血，采用自動(dòng)生化分析儀(HITACHI7150)測(cè)定。1.3.2形態(tài)學(xué)觀察：兩組大鼠于靜脈注射C-BSA2、4、6周后殺檢取腎皮質(zhì)，分別進(jìn)行如下觀察：熒光顯微鏡觀察：殺檢大鼠取腎皮質(zhì)，即刻恒溫冷凍切片，制成5m的切片，進(jìn)行免疫熒光染色，采用直接法，熒光抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記兔抗大鼠IgG抗體(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供)。光鏡觀察：取腎皮質(zhì)，20%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，制成3m切片，分別進(jìn)行HE、PAM-HE、PAM-Masson及PTAH染色，作光鏡觀察。透射電鏡觀察：取腎皮質(zhì)，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，Epon618包埋

9、，超薄切片，1%醋酸鈾染色，進(jìn)行透射電鏡(HITACHI-H600)觀察。2結(jié)果2.1腎功能檢查2.1.1尿蛋白測(cè)定：靜脈注射C-BSA1周后，病理組大部分大鼠出現(xiàn)蛋白尿，至第2周末，所有大鼠均出現(xiàn)較明顯的蛋白尿，并于第3周末達(dá)高峰。正常對(duì)照組大鼠無(wú)明顯蛋白尿。結(jié)果見(jiàn)表1。表124h尿蛋白定量結(jié)果(mg;±s；n=10)組別第2周第3周第4周第5周第6周病理組124.17±30.15*230.82±17.02*221.04±38.81*213.75±60.14*188.64±58.88*對(duì)照組20.16±5.8219.44&

10、#177;8.1222.05±6.7425.36±10.1021.68±7.84注：與對(duì)照組同期比較*P0.001 2.1.2血清肌酐測(cè)定：靜脈注射C-BSA4周后，病理組血清肌酐升高，第4、6周時(shí)與正常對(duì)照組比較，差異顯著。結(jié)果見(jiàn)表2。表2血清肌酐測(cè)定結(jié)果(Mol/L;±s；n=5)組別第2周第4周第6周病理組35.36±9.721160.99±10.61*90.17±15.91*對(duì)照組38.89±4.4240.67±11.4938.01±7.96注：與對(duì)照組比較*P0.05*P0.01 2.

11、2形態(tài)學(xué)觀察2.2.1熒光顯微鏡觀察：靜脈注射C-BSA2周后，病理組全部鼠腎標(biāo)本均可見(jiàn)IgG沿腎小球毛細(xì)血管壁呈顆粒狀沉積(照片1)。此后，沉積之IgG漸成粗顆粒狀。照片1靜脈注射C-BSA2周后，IgG沿腎小球毛細(xì)血管壁呈顆粒狀沉積?？勾笫驣gG×2002.2.2光鏡觀察：靜脈注射C-BSA2周后，病理組大鼠腎小球毛細(xì)血管壁均為一致性增厚，有多量釘突(spike)形成，并可見(jiàn)上皮下免疫沉積物(PAM-Masson染色)，半數(shù)動(dòng)物腎球囊內(nèi)有蛋白滲出，部分動(dòng)物有纖維素滲出，腎小球血管袢節(jié)段性壞死，可見(jiàn)新月體形成(照片2)。照片2靜脈注射C-BSA2周后，新月體形成，腎小球周圍纖維化。

12、PAM-HE×4004周后，部分動(dòng)物出現(xiàn)腎小球節(jié)段性硬化或整個(gè)腎小球硬化，至第6周時(shí)，4/6例(66.7%)動(dòng)物出現(xiàn)腎小球硬化(照片3)，硬化的腎小球占腎小球總數(shù)的28.5%(每張切隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)腎小球)，并可見(jiàn)硬化的腎小球與代償肥大的腎小球并存。照片3靜脈注射C-BSA6周后，腎小球硬化，腎小球周圍纖維化。PAM-HE×4002.2.3電鏡觀察：靜脈注射C-BSA2周后，病理組大鼠可見(jiàn)大量上皮下電子致密沉積物。4周后，沉積物融合成大片狀(照片4)。照片4靜脈注射C-BSA4周后，上皮下電子致密沉積物融合成大片狀。透射電鏡×80003討論Arisz等5指出，用異種

13、蛋白(如BSA)給致敏大鼠靜脈注射復(fù)制血清病性腎炎時(shí)，超敏反應(yīng)致大鼠高死亡率是一個(gè)主要問(wèn)題。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中也遇到了這個(gè)問(wèn)題。10只大鼠預(yù)免疫2周后分成2組，各為5只。其中一組給予1.0mgC-BSA靜脈注射，結(jié)果全部大鼠均很快死亡，死亡率為100%，尸檢可見(jiàn)雙肺肺水腫，布滿點(diǎn)、片狀出血。另一組首先給予劑量由小至大的腹腔注射，再逐漸過(guò)渡到靜脈注射(劑量也由小至大)，只有1只大鼠死亡(20%)。為了保證注射足夠的抗原量，同時(shí)又避免因超敏反應(yīng)而致動(dòng)物大量死亡，我們采用了后一種由腹腔至靜脈過(guò)渡的方法注射抗原，結(jié)果僅有個(gè)別動(dòng)物死亡(3/30只，10%)。靜脈注射C-BSA后，病理組大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿，I

14、gG沿腎小球毛細(xì)血管壁呈顆粒狀沉積，毛細(xì)血管壁增厚，釘突形成，大量上皮下電子致密沉積物，這些病變特點(diǎn)與Border等2報(bào)道的家兔腎炎模型的特點(diǎn)相似。但在我們的模型中，靜脈注射C-BSA2周后即有腎球囊內(nèi)大量蛋白甚至纖維素滲出，并有新月體形成，腎小球血管袢節(jié)段性壞死和隨后出現(xiàn)的腎小球硬化等病變，這與Border等的家兔模型不同(病變出現(xiàn)較早)，而且在目前用陽(yáng)離子化抗原(包括C-BSA)復(fù)制的大鼠血清病性腎炎模型中也少有報(bào)道。雖然在我們的模型中所測(cè)得的血清肌酐值均偏低，但靜脈注射C-BSA4周后，與對(duì)照組比較，病理組血清肌酐水平呈明顯升高趨勢(shì)，提示已有腎功能受損，有進(jìn)一步發(fā)展為腎衰的可能。對(duì)有硬化

15、的腎小球進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，雖然發(fā)生這類病變的動(dòng)物例數(shù)較多，但病變的腎小球占腎小球總數(shù)的百分率卻較低，占多數(shù)的、相對(duì)正常的腎小球可以發(fā)揮代償作用。光鏡下所見(jiàn)的硬化的腎小球與代償肥大的腎小球并存的現(xiàn)象很似人類慢性腎炎的特點(diǎn)。許多學(xué)者的研究表明，膜性腎炎按中醫(yī)辨證多屬腎陽(yáng)虛型，其主要臨床表現(xiàn)為陽(yáng)虛6。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪紫染哂心ば阅I炎典型的臨床表現(xiàn)(大量蛋白尿)，腎組織又可見(jiàn)到膜性腎炎典型的病理改變，說(shuō)明此病理模型當(dāng)歸屬于陽(yáng)虛型。當(dāng)膜性腎炎持續(xù)發(fā)展，其陽(yáng)虛程度也必然日益加重，至后期腎功能衰竭階段，則往往表現(xiàn)為脾腎衰敗，陽(yáng)氣大敗，并在此基礎(chǔ)上易產(chǎn)生濕濁、瘀阻等復(fù)雜變化。故以此模型作為基礎(chǔ)，用以觀察中醫(yī)藥治療慢性腎

16、炎和腎功能衰竭的作用和機(jī)理的研究，具有重要的價(jià)值。作者簡(jiǎn)介：武寶玉，男，35歲，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師作者單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室北京100029參考文獻(xiàn)1Oite T,Shimizu F,Kihara I,et al.An active model of immune complex glo merulonep hritis in the rat employing cationized antigen.Am J Pathol,1983,112：1851942Border WA,Ward HJ,Kamil ES,et al.Induction of membranous nephropat

17、hy in rabbi ts by administration of an exogenous cationic antigen.J Clin Invest,1982,69：451 4613Furness PN,Turness DR.An assessment of the influence of antigen dose in two n ew models of chronic serum sickness glomerulonephritis in the rat.Br J Exp Patho l,1987,68：5275384Bass PS,Drake AF,Wang Y,et al.Cationizat