hbsag與恒定鏈融合基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

1、727文章編號:1007-8738(2004)06-0727-02HBsAg與恒定鏈融合基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定白俊1,任軍13,韓月恒2,韓者藝3,許彥鳴2(第四軍醫(yī)大學(xué):1西京醫(yī)院腫瘤科,2西京醫(yī)院消化科,3基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,陜西西安710032)關(guān)鍵詞:恒定鏈;HBsAga位點;外來體中圖分類號:Q782文獻標(biāo)識碼:A我國是乙型病毒性肝炎的高發(fā)國家,約有1.2億的HBV攜帶者,而原發(fā)性肝癌中90%的患者有HBV感染1。研究者發(fā)現(xiàn),72.7%的肝癌癌旁組織及45%的肝癌組織中可檢出HBsAg,故其可作為肝炎后肝癌患者免疫治療的相對特異的腫瘤相關(guān)分子”2。如果能將HBsA

2、g附加到來源于肝癌細胞的外來體上,再用外來體去免疫宿主,便可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對腫瘤排斥抗原及HBsAg的雙靶向免疫應(yīng)答。本研究中,我們構(gòu)建了以HBsAga位點基因替換CD74分子的II類相關(guān)抗原恒定鏈(classII2associatedinvariantchainpep2tide,CLIP)片段基因的真核表達質(zhì)粒,并證實轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的HepG2細胞可表達出HBsAg,為構(gòu)建針對肝炎后肝癌的雙靶向外來體瘤苗奠定實驗基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料pcDNAI/AMP質(zhì)粒(含已剔除CLIP基因片段的人CD74分子基因),由荷蘭雷登大學(xué)(LeidenUniversity)VanBergenJ教授惠贈。pcDN

3、A3.1/V5his質(zhì)粒為Invitrogen公司產(chǎn)品,由本院消化科韓者藝博士惠贈。Top10克隆菌株為Invitrogen公司產(chǎn)品,由本?；A(chǔ)部生化教研室惠贈。HepG2細胞系由本科室保存。lipofectamine2000轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體為Invit2rogen公司產(chǎn)品。胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品。HBVSurface免疫組化檢測試劑盒,為天津市津脈基因測繪技術(shù)有限公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建以Eco47和Bsp119I雙酶切pcD2NAI/AMP質(zhì)粒,回收大片段備用。同時將Sa基因與經(jīng)雙酶切的pcDNAI/AMP質(zhì)粒大片段連接,轉(zhuǎn)化Top

4、10克隆菌株感受態(tài)細胞。鋪板挑克隆,搖菌提取質(zhì)粒,以F74和HBsAga2為引物,以所提質(zhì)粒為模板,用PCR擴增初步鑒定提取的質(zhì)粒,并將其命名為pSa。以BamHI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pSa,回收酶切下的約700bp的小片段備用。同時用BamHI和XhoI雙酶切pcDNA3.1/V5his質(zhì)粒,回收約5kb的大片段備用。以T4DNA連接酶連接回收的700bp小片段和5kb的pcDNA3.1收稿日期:2004-09-22;修回日期:2004-10-08基金項目:軍隊“十五”杰出青年基金資助項目(No.01J16)作者簡介:白3俊(1973-),男,湖北武漢人,博士.Corrrespondinga

5、uthor,Tel:(029)83375407Email:renjun/V5his質(zhì)粒大片段,并以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10克隆菌株感受態(tài)細胞。鋪板挑克隆,搖菌提取質(zhì)粒,再以BamHI和XhoI雙酶切鑒定所提質(zhì)粒。挑取酶切鑒定合格的質(zhì)粒進行DNA序列測定,最終鑒定所構(gòu)建的質(zhì)粒,命名為pcIiSa。大量制備pcIiSa目的質(zhì)粒,置-20凍存?zhèn)溆?。擴增CD74基因的正向引物F74為:52ACATTggATCCTCCTTggggAgTgATgCAC23;擴增CD74基因的反向引物R74為:52ACTggTggTgACTgggCCCAgATCCTg23。HBsAga位點基因Sa,由等摩爾的HB2sAga1

6、和a2室溫退火獲得。退火所得Sa基因的兩端,分別含有Eco47和Bsp119I的酶切位點。HBsAga1的序列為:52CgAAgTgCACgACTCCTgCTCAAggCAACTCTATgTTTCCCTCATgTTgCTgTACAAAACCTACggACggAAATTgCAgC23;HBsAga2的序列為:52gCTgCAATTTCCgTCCgTAggTTTTgTACAgCAACATgAgggAAACATAgAgTTgCCTTgTgCAggAgTCgTgCACTT23。1.2.2pcIiSa質(zhì)粒在HepG2細胞系中的表達接種HepG2細胞于6孔板中,待細胞生長至50%80%匯合時,棄去細胞培養(yǎng)

7、液,用無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞1次,將Lipofectamine20002DNA混合物200L與800L無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕混勻,小心滴加至細胞上,置37、50mL/L的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h。棄去轉(zhuǎn)染液,加2mL含100mL/L胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后72h用2.5g/L胰酶消化后,將細胞滴于直徑12cm平皿內(nèi)的經(jīng)明膠處理的載玻片上。待細胞牢固貼壁后,用PBS輕輕沖洗兩遍,以冷丙酮固定5min,用免疫細胞化學(xué)染色檢測重組質(zhì)粒在細胞內(nèi)的瞬時表達。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒的電泳鑒定重組質(zhì)粒pSa的鑒定采用PCR擴增的方法,所用模版均為pSa質(zhì)

8、粒。將PCR產(chǎn)物進行10g/L瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明,引物F74和R74組擴增出約750bp大小的特異性條帶;引物F74和HBsAga2組擴增出約400bp大小的特異性條帶(圖1)。將重組質(zhì)粒pIiSa用BamHI和XhoI雙酶切后,可從pIiSa上切下約750bp的核酸片段,同預(yù)期的融合基因大小相符(圖2)。2.2pIiSa質(zhì)粒的序列測定將pIiSa質(zhì)粒的測序結(jié)果(見下)同人CD74分子的同源性比較顯示,在pIiSa質(zhì)粒中克隆有CD74和HBsAga位點的融合基因。pIiSa質(zhì)粒的核苷酸序列為:GGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATG2GAT

9、GACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCT2GTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCAC2CACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAAC“728TGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTTTCGAAGTGCACGACTCCTGCACAAGGCAACTCTATG

10、TTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGACGGAAATTGCAGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCC

11、CACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGG。可以看出,HBsAga位點基因(序列中的黑斜體部分)通過Eco47和Bsp119I兩個酶切位點定向克隆入CD74基因,取代了恒定鏈的CLIP片段。圖1PCR初步鑒定pSa質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定a:以F74和HBsAga2為引物擴增的產(chǎn)物;b:以F74和R74為引物擴增的產(chǎn)物;c:DL2000DNAmarker(由上至下依次為2000、1000、750、500、250和100bp).圖2pIiSa質(zhì)粒的雙酶切鑒定c:DL2000DNAmarker(由上至下依次為2000、1000、750、500、250和100bp);d:p

12、IiSa/BamHI+XhoI;e:pIiSa質(zhì)粒.2.3pIiSa質(zhì)粒的真核表達光鏡下觀察,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5his空載體組的HepG2細胞無論細胞核、胞質(zhì),還是胞膜均無棕色顆粒;而轉(zhuǎn)染pIiSa質(zhì)粒的HepG2細胞90%以上有程度不同的棕色顆粒沉著。棕色顆粒主要位于胞質(zhì)內(nèi),呈不均勻的塊狀分布,胞膜上也有少量顆粒附著(圖3)。圖3pIiSa質(zhì)粒在HepG2細胞中表達的免疫細胞化學(xué)染色檢測(×200)A:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5his空載體的HepG2細胞;B:轉(zhuǎn)染pIiSa質(zhì)粒的HepG2細胞.3討論外來體(exosome)為一種直徑為5090nm的膜性微囊結(jié)構(gòu),因其在造

13、血系統(tǒng),尤其是免疫細胞之間物質(zhì)轉(zhuǎn)運中的獨特作用而逐漸引起免疫學(xué)者和臨床腫瘤學(xué)家的關(guān)注。腫瘤細胞也可產(chǎn)生外來體3,當(dāng)其被DC攝取后可誘導(dǎo)CD8+T細胞介導(dǎo)的針對不同低免疫原性腫瘤的保護性應(yīng)答,從而推測腫瘤細胞來源的外來體,可將共有腫瘤排斥抗原傳遞給DC。因此,外來體是具有良好應(yīng)用價值及開發(fā)前景的非細胞性腫瘤疫苗。VanDeurs等4研究證實,外來體來源于細胞內(nèi)的多囊體。由于外來體在多囊體中形成,要將目的抗原附加到外來體上,就必須將目的抗原引入多囊體中,這就需要相應(yīng)的引導(dǎo)肽。恒定鏈(invariantchain,Ii)是一種型糖蛋白,編碼Ii的是單基因。Ii鏈?zhǔn)且粋€將目的抗原附加到MHC類分子的良

14、好引導(dǎo)分子,可將目的抗原引入多囊體。VanBergen等5通過基因重組技術(shù),將CD74分子中的CLIP片段置換成流感病毒的血凝素第307319位氨基酸(HA307319),并證實可將該抗原附加到MHCII類分子上,因而成功地誘導(dǎo)出針對HA307319的輔助性T細胞應(yīng)答。我們通過基因重組技術(shù),構(gòu)建了用HBsAga位點基因替換CD74分子中CLIP片段基因的真核表達質(zhì)粒,以期在真核細胞中表達出HBsAga位點與CD74分子的融合蛋白。利用CD74分子上的引導(dǎo)肽,將HBsAga位點抗原入多囊體中,即進入外來體的形成通路,將HBsAga位點抗原附加到外來體上。由于HBsAga位點基因Sa只有30多個核

15、苷酸,無法用酶切鑒定的方法挑選目的克隆,所以采用了以HBsAga2和F74為引物進行PCR擴增的方法。若Sa基因已克隆入pcDNAI/AMP質(zhì)粒,其擴增產(chǎn)物應(yīng)為CD74基因的前半段與Sa的融合基因,大小約為400bp,否則便不能擴增出特異性條帶。重組質(zhì)粒pSa用引物F74和R74可擴增出約750bp的特異性條帶,說明該質(zhì)粒中含有CD74基因。用F74和HBsAga2為引物可擴增出約400bp的特異性條帶,說明Sa基因已連接入pSa質(zhì)粒中。雙酶切鑒定證明,pIiSa質(zhì)粒中可能重組了CD74與Sa的融合基因。測序結(jié)果及同源性比較(數(shù)據(jù)未列出)證實,該重組質(zhì)粒中含有CD74和Sa的融合基因。轉(zhuǎn)染了空

16、載體的對照組細胞染色呈陰性,而轉(zhuǎn)染pIiSa質(zhì)粒的HepG2細胞的胞漿染色呈陽性,說明構(gòu)建的pIiSa重組質(zhì)粒可在真核細胞中表達HBsAg。以上結(jié)果為構(gòu)建針對肝炎后肝癌的雙靶向外來體瘤苗奠定了基礎(chǔ)。參考文獻:1湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)M.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1993:533-585.2ShenLJ,ZhangHX,ZhangZJ,etal.DetectionofHBV,PCNAandGST2piinhepatocellularcarcinomaandchronicliverdiseasesJ.WorldJGastroenterol,2003,9(3):459-562.3WolfersJ,LozierA,RaposoG,etal.Tumor2derivedexosomesareasourceofsharedtumorrejectionantigensforCTLcross2primingJ.NatMed,2001,7(3):297-303.4VanDeur