藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與篩選(2).

1、ESTEST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA cDNA 克隆進(jìn)行克隆進(jìn)行55端和端和33端端單一次測(cè)序獲得的短的單一次測(cè)序獲得的短的cDNA cDNA 部分序列部分序列, ,代表一個(gè)完整代表一個(gè)完整基因的一小部分基因的一小部分, ,在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從20 20 到到7000bp 7000bp 不等不等, ,平均長(zhǎng)度為平均長(zhǎng)度為360 360 120bp 120bp 。EST EST 來(lái)源于來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA mRNA 所構(gòu)建的所構(gòu)建的cDNA cDNA 文庫(kù)文庫(kù), ,因此因此ESTEST也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。

2、也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。首先從樣品組織中提取首先從樣品組織中提取mRNA ,mRNA ,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下用在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下用oligo ( dT) oligo ( dT) 作為引物進(jìn)行作為引物進(jìn)行RT -PCR RT -PCR 合成合成cDNA ,cDNA ,再選擇再選擇合適的載體構(gòu)建合適的載體構(gòu)建cDNA cDNA 文庫(kù)文庫(kù), ,對(duì)各菌株加以整理對(duì)各菌株加以整理, ,將每一將每一個(gè)菌株的插入片段根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行兩個(gè)菌株的插入片段根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行兩端一次性自動(dòng)化測(cè)序端一次性自動(dòng)化測(cè)序, ,這就是這就是EST EST 序列的產(chǎn)生過(guò)程。序列的產(chǎn)生過(guò)程。Id

3、entification of PD-related genesCopyright restrictions may apply.Kim, J.-M. et al. DNA Res 2006 13:275-286Quantitative real-time RT-PCR of upregulated or downregulated genes randomly selected from the libraries of human normal SN (黑質(zhì)黑質(zhì))and PDs SNCopyright restrictions may apply.Kim, J.-M. et al. DNA

4、 Res 2006 13:275-286; doi:10.1093/dnares/dsl016Immunohistochemical staining for TH and alpha-tubulin in the SN of an MPTP mice modelTHalpha-tubulinCopyright restrictions may apply.Cell death activity of differentially expressed genes in PDUpregulated genesDownregulated genes基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene C

5、hip）通常指）通常指DNADNA芯片，其基本原理芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量?；蛐酒母拍瞵F(xiàn)已泛化到斷樣品中靶分子的數(shù)量?；蛐酒母拍瞵F(xiàn)已泛化到生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）、微陣列（）、微陣列（MicroarrayMicroarray）、）、DNADNA芯片（芯片（DNA chipDNA chip），甚至蛋白芯片。），甚至蛋白芯片。 INH(異煙阱異煙阱)-induced mR

6、NA expression profiles monitored by microarray hybridization analysis. 用用INHINH處理處理INH INH 敏感敏感的結(jié)核菌株的結(jié)核菌株( (紅紅:INH:INH處處理的理的; ;綠綠:INH:INH未處理的未處理的) )PNAS 1999; 96(22):12833-12838. 用用INH處理處理INH 耐藥的結(jié)核菌株耐藥的結(jié)核菌株用乙硫異煙胺處理用乙硫異煙胺處理INH 耐藥的結(jié)核菌株耐藥的結(jié)核菌株Temporal profile of INH-induced expression of selected genes

7、. PNAS 1999; 96(22): 12833-12838.Roles of INH-induced genes in the context of a proposed pathway for mycolic acid (結(jié)核環(huán)脂酸結(jié)核環(huán)脂酸)biosynthesis. PNAS 1999; 96(22):12833-12838. The ChIP-DSL scheme PNAS 2007; 104（2): 4852-4857 E2-induced gene expression and the biological relevance of direct ER target gene

8、sPNAS 2007; 104（2): 4852-4857 E2-induced gene expression and the biological relevance of direct ER target genesPNAS 2007; 104（2): 4852-4857 Luo et al., Stem Cells 2010Zhang et al., J Neurosci 2010把靶基因表達(dá)的調(diào)控序列與編碼某種酶活性的基因把靶基因表達(dá)的調(diào)控序列與編碼某種酶活性的基因相連轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)相連轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), ,通過(guò)簡(jiǎn)單地檢測(cè)酶活性的變化通過(guò)簡(jiǎn)單地檢測(cè)酶活性的變化, ,就可以反映化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄因

9、子和基因表達(dá)的作用性就可以反映化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)的作用性質(zhì)和程度。這種能間接反映基因轉(zhuǎn)錄水平的編碼某質(zhì)和程度。這種能間接反映基因轉(zhuǎn)錄水平的編碼某種酶活性的基因稱為報(bào)告基因。種酶活性的基因稱為報(bào)告基因。 Structure of SB 247464 Science. 1998;281(5374):257-259 Activity of G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞集落刺激因子) and SB 247464 in NFS60 cell luciferase assays Science. 1998;281(5374):257-259 Phosphorylation of signa

10、ling proteins in cells treated with SB 247464 or G-CSF. Science. 1998;281(5374):257-259 The murine G-CSF receptor confers responsiveness to SB 247464. Science. 1998;281(5374):257-259未轉(zhuǎn)染受體未轉(zhuǎn)染受體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染CSF受體受體Granulocytic colony formation in response to SB 247464 in vitro. Granulopoietic activity of SB 24

11、7464 in vivo. Science. 1998;281(5374):257-259 Drug entry route into C. elegans(Drug entry route into C. elegans(秀麗隱桿線蟲秀麗隱桿線蟲) )Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 The serotonergic synapse of C. elegans.Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Overview of the RNA interference supported target identifica

12、tion processNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Chemical genetics as a tool for target site identificationNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Chemical genetics as a tool for target site identificationNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398核酶核酶: :用于描述具有催化活性的用于描述具有催化活性的RNA,RNA,即化學(xué)本即化學(xué)本 質(zhì)是核糖核酸質(zhì)是核糖核酸(RNA

13、)(RNA)， 卻具有酶的催化功能。卻具有酶的催化功能。 雞的卵清蛋白基因初始雞的卵清蛋白基因初始RNARNA轉(zhuǎn)錄物的剪接轉(zhuǎn)錄物的剪接 Relative growth rate of strains expressing ribozymes with DTA sequences as the 3 exon Nucleic Acids Res. 2002;30(24):e141 Table 1. PS-ODNs targeting the M. tuberculosis 30, 32A, and 32B protein (分枝酰基轉(zhuǎn)移酶分枝?；D(zhuǎn)移酶)gene transcripts PS-OD

14、Ns: antisense phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides ; MM: 錯(cuò)配的核苷酸錯(cuò)配的核苷酸HPS-ODNs: 5-, 3-hairpin-modified PS-ODNs 發(fā)夾修飾的反義寡核苷酸發(fā)夾修飾的反義寡核苷酸Inhibition of M. tuberculosis growth by antisense HPS-ODNs specific for the 30/32-kDa protein gene complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204Specif

15、ic inhibition of protein synthesis by antisense HPS-ODNs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204Inhibition of 30, 32A, and 32B protein gene transcript synthesis Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204HPS-ODN inhibition of M. tuberculosis multiplication in human macrophages Proc Na

16、tl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204 轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)CHS GeneCHS Gene矮牽?；ò珷颗；?Jorgensen, R, 1990)CHS: CHS: 與色素合成相關(guān)的與色素合成相關(guān)的酶酶, , 以加深花的顏色以加深花的顏色RNAi 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲（線蟲（C. elegans)C. elegans)(Andrew Fire, 1998)+Par-1 Gene DisruptionExpressionDownDouble Strand RNA線線 蟲，蟲， 果果 蠅蠅微生物，微生物， 植植

17、物物 失敗的原因失敗的原因: :在合成反義在合成反義RNARNA時(shí)存在技術(shù)問(wèn)題時(shí)存在技術(shù)問(wèn)題, ,用于注射的正用于注射的正義和反義義和反義RNARNA中都混有少量雙鏈中都混有少量雙鏈RNARNAdsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表達(dá)的機(jī)理抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNA associatedWith RISC complexCell Membrane5POH3Target mRNADicer: Dicer: 是一種核酸是一種核酸酶酶, ,將雙鏈將雙鏈RNARNA降解成降解成21-23bp21-23bp的小干擾的小干擾RNARNARISC: RNAR

18、ISC: RNA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的沉默小體沉默小體, ,他是由他是由單鏈單鏈siRNAsiRNA與一些與一些蛋白形成的復(fù)合體蛋白形成的復(fù)合體RNARNA干擾干擾(RNA interference, RNAi)(RNA interference, RNAi) RNAi RNAi 是將一段雙鏈的是將一段雙鏈的RNA RNA 序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中, ,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會(huì)受到抑制機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會(huì)受到抑制, ,甚至表達(dá)受到完全抑制甚至表達(dá)受到完全抑制Luo et al., Stem Cells 2010Decreased human MK

19、expression in PC-3 cells transfected with various siRNAsCancer. 2006;107(4):864-873 MK: MK: 肝素結(jié)合細(xì)胞因子肝素結(jié)合細(xì)胞因子Effect of treatment with MK siRNA combined with PTX (紫杉醇) on PC-3 cell viability and anchorage- independent growthCancer. 2006;107(4):864-873 PTX:siRNA-SCR:siRNA-SCR:亂序亂序siRNSsiRNSDeterminatio

20、n of a suitable dose and the duration of the siRNA to downregulate MK in PC-3 xenograftsCancer. 2006;107(4):864-873 Antitumor effect of MK siRNA in PC-3 xenografts.Cancer. 2006;107(4):864-873 抗體除對(duì)組織和細(xì)胞中特異性抗原進(jìn)行定位外，尚有強(qiáng)抗體除對(duì)組織和細(xì)胞中特異性抗原進(jìn)行定位外，尚有強(qiáng)大的中和能力阻斷蛋白質(zhì)功能。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的靶分子，大的中和能力阻斷蛋白質(zhì)功能。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的靶分子，需要以合適的方式將抗體導(dǎo)

21、入細(xì)胞。顯微注射是一種將需要以合適的方式將抗體導(dǎo)入細(xì)胞。顯微注射是一種將抗體注入細(xì)胞的方式，但是這種方式難以做到高通量，抗體注入細(xì)胞的方式，但是這種方式難以做到高通量，影響了藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證的速度。為了滿足高通量研究影響了藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證的速度。為了滿足高通量研究的需要，的需要，Moris Moris 創(chuàng)建了一套化學(xué)試劑方法將抗體導(dǎo)入細(xì)創(chuàng)建了一套化學(xué)試劑方法將抗體導(dǎo)入細(xì)胞，而抗體的功能和細(xì)胞的活性不受影響。另一種將抗胞，而抗體的功能和細(xì)胞的活性不受影響。另一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞的方式是讓抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)體導(dǎo)入細(xì)胞的方式是讓抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(intrabodies)(intrabodies)，其中包

22、括使用滅活病毒的方法。其中包括使用滅活病毒的方法。 A bispecific, tetravalent intradiabody J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819Intrabody and Tie-2/VEGF-R2 colocalization on HUVEC J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819A, kinetics of surface expression of Tie-2 and VEGF-R2 after gene transfer of the intradiabody and convention

23、al scFv intrabodies on HUVEC using recombinant adenoviruses with an MOI of 10 B, gene transfer of intrabodies directed to human Tie-2, VEGF-R2, or Tie-2/VEGF-R2 by recombinant adenoviruses on day 6 after infection J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819Inhibition of capillary tube formation in vitro J

24、 Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819 CALlCALl能夠直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行操作，而不是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)能夠直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行操作，而不是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)量的變化進(jìn)行檢測(cè)。將標(biāo)記有孔雀綠染料的非功能滅活量的變化進(jìn)行檢測(cè)。將標(biāo)記有孔雀綠染料的非功能滅活抗體與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行激抗體與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行激光照射。染料受激光激發(fā)短暫的產(chǎn)生活性分子，對(duì)結(jié)合光照射。染料受激光激發(fā)短暫的產(chǎn)生活性分子，對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)造成破壞而起到滅活作用，但不影響其他蛋白的蛋白質(zhì)造成破壞而起到滅活作用，但不影響其他蛋白質(zhì)組分。質(zhì)組分。A lentivira

25、l system for simultaneous knockdown and rescue with a functional EGFP-fusion complement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-CP induces the formation of dorsal ruffles and filopodia only in the knockdown/rescue background. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI

26、 of EGFP-CP in KDR cells generates a local increase in barbed ends of actin filaments and dorsal F-actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-Mena in Mena/VASP-deficient cells induces more stable lamellipodial protrusions Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707 基因是一

27、段基因是一段DNADNA（脫氧核糖核酸分子脫氧核糖核酸分子）雙鏈。）雙鏈。 堿基成對(duì)出現(xiàn)堿基成對(duì)出現(xiàn): -ATCGGCC-: -ATCGGCC- -TAGCCGG- -TAGCCGG- 中心中心法則（法則（The The C Central entral D Dogmaogma） 一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) - - 氨基酸序列氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu) - - 主要由氫鍵穩(wěn)固的局部構(gòu)象，主要由氫鍵穩(wěn)固的局部構(gòu)象， 如如 -helix, -helix, -sheet-sheet等等三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu) - - 三維構(gòu)象三維構(gòu)象四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu) - - 多個(gè)多肽鏈的組合多個(gè)多肽鏈的組合分子表面分子表面 - 分子

28、可視化分子可視化 - 分子對(duì)接分子對(duì)接 - 基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì) - 生物學(xué)問(wèn)題生物學(xué)問(wèn)題的提出的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備樣品的制備蛋白樣品的蛋白樣品的IEF和和PAGE電泳分離電泳分離圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點(diǎn)蛋白點(diǎn)的切取的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步的進(jìn)一步驗(yàn)證驗(yàn)證蛋白信息的蛋白信息的初步獲得初步獲得蛋白質(zhì)組研究

29、的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳雙向電泳圖像分析圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定蛋白質(zhì)二維電泳：蛋白質(zhì)二維電泳：蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)提取樣品前處理樣品前處理一向等一向等電聚焦電聚焦二向二向SDSPAGE凝膠銀染及掃描凝膠銀染及掃描雙向電泳分雙向電泳分析軟件分析析軟件分析差異蛋白差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)普分析普分析生物信息數(shù)據(jù)

30、查詢、建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息數(shù)據(jù)查詢、建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)可溶性樣品可溶性樣品 固體組織樣品固體組織樣品 細(xì)胞細(xì)胞不同樣品的基本處理方法不同樣品的基本處理方法樣品的分級(jí)處理樣品的分級(jí)處理通過(guò)采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。 垂直板凝膠垂直板凝膠電泳裝置電泳裝置加樣加樣樣品遷樣品遷移方向移方向電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的一個(gè)帶孔膠粒。子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的

31、一個(gè)帶孔膠粒?；旌蠘悠坊旌蠘悠穾Э啄z帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子夾在兩塊玻璃夾在兩塊玻璃板之間的凝膠板之間的凝膠 電泳電泳緩沖液緩沖液 電泳電泳緩沖液緩沖液 加在槽中的經(jīng)加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品處理的樣品分子量小分子量小分子量大分子量大電源電源電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以通線性關(guān)系，所以可

32、以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量鏈分子量。 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率水平式電泳裝置水平式電泳裝置電泳緩沖液電泳緩沖液凝膠凝膠B. 等電聚焦等電聚焦電泳（電泳（ IFE） 利用聚丙烯酰利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下沿電在電場(chǎng)作用下沿電場(chǎng)方向在凝膠內(nèi)制場(chǎng)方向在凝膠內(nèi)制造一個(gè)造一個(gè)pH梯度。梯度。 每種蛋白質(zhì)都每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的將遷移至與它的pI 相一致的相一致的pH處。處。凝膠中加凝膠中加有兩性電有兩性電解質(zhì)溶液解質(zhì)溶液（pH9-3） 加電場(chǎng)后加電場(chǎng)后在凝膠內(nèi)形在凝膠內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)定成一個(gè)穩(wěn)定pH梯度梯度 加樣品，加樣品，然后繼續(xù)然后繼續(xù)電泳電泳凝膠

33、染色表明凝膠染色表明樣品按照各自樣品按照各自pI值沿著值沿著pH梯度分布梯度分布等等電電聚聚焦焦電電泳泳進(jìn)進(jìn)行行過(guò)過(guò)程程中中等等電電聚聚焦焦電電泳泳結(jié)結(jié)束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH：等電聚焦電泳：等電聚焦電泳：SDS-PAGE 雙向電泳后的凝膠雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：分布圖： 水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差異，上的差異，垂直方向反映出它們?cè)诖怪狈较蚍从吵鏊鼈冊(cè)诜肿恿可系牟顒e分子量上的差別。第一向電第一向電泳：等電泳：等電聚焦電泳聚焦電泳聚焦后凝聚焦后凝膠放置在膠放置在SDS凝膠凝膠上，進(jìn)行上

34、，進(jìn)行第二向電第二向電泳泳第二向電泳：第二向電泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備樣品制備 與與IPG膠條水化膠條水化 IPG電泳電泳 與上樣緩沖液浸潤(rùn)與上樣緩沖液浸潤(rùn) SDS-PAGE 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)PVDF膜膜 膠內(nèi)直接染色膠內(nèi)直接染色 染色染色 取出蛋白點(diǎn)取出蛋白點(diǎn) 胰酶等消化胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上濃縮于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指紋圖肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定 已知已知 反向反向HPLC分離分離 MALDI-MS，PSD片段分析片段分析示知示知 ESI-MS-MS、微測(cè)序、微測(cè)序 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物肽混合物質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計(jì)算方法計(jì)算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)）肽質(zhì)量檢索：肽質(zhì)量