LSA21大孔吸附樹脂富集何首烏中二苯乙烯的工藝研究

1、LSA-21大孔吸附樹脂富集何首烏中二苯乙烯的工藝研究曹騁，賈薇*，王術(shù)玲，陳豐連，曾元兒（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 510006）摘要 目的：研究LSA-21型大孔樹脂對何首烏二苯乙烯苷的吸附性能及分離純化工藝參數(shù)。方法：采用高效液相色譜法測定2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷含量，計(jì)算LSA-21大孔樹脂對二苯乙烯苷的吸附率和解吸率。結(jié)果：最佳吸附純化工藝為：最大上樣量為1.2g/g(生藥量/干樹脂),藥液濃度為0.2g/mL(相當(dāng)于生藥量)，吸附流速為1.0mL/min,60%乙醇洗脫,洗脫劑用量為60mL，洗脫流速為1.0mL/min。結(jié)論：LSA-21大孔樹脂

2、對何首烏二苯乙烯苷的吸附純化效果較好，本研究結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞： 何首烏；二苯乙烯苷；LSA大孔吸附樹脂中圖分類號(hào) R283.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)1005-9903（2011）10-Study on the Technology of Enrichment of Stilbene Glycoside in Polygonum multiflorum with LSA-21 Marcoporous ResinCAO Cheng , JIA Wei , WANGShu-ling, CHENFeng-lian, ZENGYuan-er（Traditional Chinese

3、Pharmaceutical College of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510006,China)Abstract Objective: To study the conditions and parameters of purifying stilbene glycoside from Polygonum multiflorum Thunb. Method: HPLC was applied to determine the content of 2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-ß-D-g

4、lycoside, and calculate the adsorption rate and desorption rate. Result: The optimum process condition was as follows: 60% ethanol was used as eluting solvent; the adsorption velocity was 1.0 mL·min-1, and the solution concentration was 0.2 g·mL-1; elution velocity was 1.0mL/min. Conclusio

5、n: The desorption purification effect of LSA-21 marcoporous resin is good. So this method of purification is advisable. The results of this study can provide theoretical basis for practical production.Key words Polygonum multiflorum Thunb.; stilbene glycoside; LSA-21 marcoporous resin何首烏為蓼科植物何首烏Poly

6、gonum Multiflorlum Thunb.的干燥塊根，具有補(bǔ)肝、益腎、養(yǎng)血、祛風(fēng)之功效，能解毒，消癰，截虐，潤腸通便。用于瘡癰，瘰疬，風(fēng)疹瘙癢，久虐體虛，腸燥便秘1。何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類、糖類等成分。二苯乙烯苷具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動(dòng)脈硬化及保肝等作用。大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)是一種純化新工藝，可以達(dá)到分離、富集收稿日期20110112（001）第一作者曹騁，講師，碩士，從事中藥分析及配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)相關(guān)研究， 電話：， E-mail：通訊作者*賈薇，講師，博士，從事中藥分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，電話：，E-mail：中藥有效部位或有效成分的目的。為

7、了更好地分離純化何首烏中二苯乙烯苷，發(fā)揮何首烏的藥效，本研究主要考察LSA-21樹脂對何首烏二苯乙烯苷的吸附性能及工藝參數(shù)，旨在尋找出最適宜的動(dòng)態(tài)吸附工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1 儀器與試藥島津LC-10AT高效液相色譜儀， SPD-10Av檢測器， Kromasil C18色譜柱( 4.6mm×250mm，5m)，766-3型KETONG 遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱。何首烏（購自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum Multiflorlum Thunb.的干燥塊根），2,3,5,4 - 四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄

8、糖苷（中國藥品生藥制品檢定所，批號(hào)110844-200606）；LSA-21型大孔吸附樹脂（西安藍(lán)曉科技有限公司），乙腈為色譜純（Merck)，水為蒸餾水，其余試劑為分析純。2 方法2.1 何首烏上樣液的制備 稱取何首烏藥材粉末（過一號(hào)篩）適量，置圓底燒瓶中，加10倍體積50%乙醇，置恒溫水浴鍋中加熱回流提取2次，每次1h，合并提取液，濾過，濾液經(jīng)減壓濃縮至無醇味，高速離心（3000r·min-1），取上清液，調(diào)節(jié)濃度至0.2g/mL（相當(dāng)于生藥量），即得。2.2 二苯乙烯苷的含量測定2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈-水（25 : 75）；檢測波長320nm；柱溫：室溫；流速：1.

9、0mL/min，進(jìn)樣量10l。2.2.2對照品溶液的制備 取2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷對照品適量，加50%乙醇制成每1mL含0.2mg的溶液2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取何首烏上樣液（或流出液）1mL，置25mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，過0.45m微孔濾膜，即得。2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷對照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00mL置5mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得線性方程為Y=115759394X+6

10、28349 （r=0.9994）。結(jié)果表明2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷進(jìn)樣濃度在0.020.16 g·L-1線性關(guān)系良好。2.2.5精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定二苯乙烯苷峰面積，結(jié)果峰面積RSD 0.3%，表明測定方法精密度良好。2.2.6 測定 按2.2.1及2.2.3項(xiàng)下方法，分別進(jìn)樣測定二苯乙烯苷峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。3. 動(dòng)態(tài)吸附性能考察3.1 大孔樹脂預(yù)處理2 取LSA-21樹脂適量，加入95%乙醇回流至洗脫液蒸干后無殘留，洗凈的樹脂揮去溶劑后保存?zhèn)溆?。以乙醇濕法裝柱,乙醇洗脫,至流出的乙醇液用水

11、稀釋不渾濁為止(取1 mL乙醇加5 mL水)，用純化水洗至無醇味，備用。3.2 靜態(tài)吸附解吸性能考察 筆者在優(yōu)選大孔樹脂型號(hào)前期研究中，曾通過靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)測出LSA-21樹脂對二苯乙烯苷的靜態(tài)吸附率，洗脫率最大可達(dá)86%及89%，分離效率為77%3。3.3吸附流速的確定 分別取已預(yù)處理的LSA-21大孔樹脂5份，每份5g，裝柱。取上樣液20 mL分別以0.5，1.0，1.5，2.0 mL/min的流速上樣，收集各流速下的流出液，按2.2.6項(xiàng)下方法測定二苯乙烯苷含量，計(jì)算吸附率。結(jié)果二苯乙烯苷吸附率隨吸附流速的增大而逐漸下降，流速大于1.0mL/min，二苯乙烯苷吸附率顯著下降，吸附流速

12、為0.5mL/min時(shí)吸附率最大，但上樣時(shí)間長，故選定最佳吸附流速為1.0mL/min。見圖1。圖1 吸附流速對二苯乙烯苷吸附率的影響3.4上樣液濃度影響 稱取已預(yù)處理LSA-21型樹脂5g，共4份，裝柱，另取濃度為0.1，0.2，0.3，0.4g /mL （相當(dāng)于生藥量）的上樣液10mL，以1.0 mL/min的吸附流速上樣，待吸附完全后，按2.2.6項(xiàng)下方法測定二苯乙烯苷含量，計(jì)算吸附率。結(jié)果上樣液濃度大于0.2 g/mL（相當(dāng)于生藥量）后，LSA-21樹脂對二苯乙烯苷的吸附率逐漸下降。上樣液濃度為0.1 g/mL（相當(dāng)于生藥量）時(shí)，二苯乙烯苷吸附率最高，但此濃度藥液較稀，純化所需時(shí)間長，

13、故上樣液濃度選擇0.2 g/mL（相當(dāng)于生藥量）較為適宜。見圖2。圖2 上樣液濃度對LSA-21型大孔樹脂吸附率的影響3.5 最大上樣量的確定 稱取已預(yù)處理的LSA-21樹脂10g，裝柱，另取0.2 g/mL（相當(dāng)于生藥量）的上樣液，上樣，吸附流速為1.0 mL/min，用具塞試管收集流出液，每10mL收集一份，按2.2.6項(xiàng)下方法測定二苯乙烯苷含量，計(jì)算未吸附率。以藥液體積為橫坐標(biāo)，未吸附率為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線。結(jié)果隨著上樣液體積增加，未吸附率逐漸增加，60mL以后未吸附率顯著上升，此時(shí)二苯乙烯苷大量泄漏，樹脂對二苯乙烯苷的吸附能力顯著下降，故確定60mL為最大上樣量，此時(shí)未吸附率未超過10

14、%。見圖3。圖3 最大上樣量3.6 乙醇濃度考察 取LSA-21樹脂10g，裝柱，用上樣液吸附飽和，用水洗至流出液無色澄清后，依次以5倍柱體積20%乙醇，40%乙醇，60%乙醇，80%乙醇，95%乙醇洗脫樹脂柱，收集各段洗脫液。按2.2.6項(xiàng)下方法測定各段洗脫液中二苯乙烯苷含量，結(jié)果隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫液中二苯乙烯苷的含量逐漸增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%后，洗脫液中二苯乙烯苷的量明顯降低，可認(rèn)為樹脂上的二苯乙烯苷已基本洗脫完全，故選定洗脫液乙醇濃度為60%。見圖4。圖4 洗脫液濃度的影響3.7 洗脫流速的影響 取已經(jīng)吸附飽和的樹脂用水洗至流出液澄清并無色后，以4倍柱體積60%乙醇洗脫

15、，分別調(diào)節(jié)流速為0.5，1.0，1.5，2.0 mL/min，收集洗脫液。按2.2.6項(xiàng)下方法測定洗脫液中二苯乙烯苷含量，結(jié)果隨著流速的增大，洗脫逐漸上升，當(dāng)流速為1.0mL/min時(shí)，洗脫率達(dá)到最大，故確定洗脫流速為1.0mL/min。見圖5。圖5洗脫流速的影響3.8 洗脫曲線 取已用上樣液吸附飽和的樹脂10g，用蒸餾水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，以60%乙醇100mL洗脫，洗脫流速1.0 mL/min，每10 mL 收集一次洗脫液。按2.2.6項(xiàng)下方法測定各段洗脫液中二苯乙烯苷含量。結(jié)果流脫液中二苯乙烯苷的量隨著洗脫體積的增大逐漸減少，到第60mL時(shí)，二苯乙烯苷含量已經(jīng)很少，可認(rèn)為二苯乙烯苷已基本

16、洗脫完全，故選擇60%乙醇洗脫劑體積為60mL。見圖6 。圖6 洗脫劑用量考察3.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取LSA-21樹脂10g，上柱，分別加入0.2 g/L（相當(dāng)于生藥量）何首烏上樣液60mL進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換吸附，吸附流速為1.0mL/min，收集流出液，待吸附完全后加水洗至流出液接近無色后，加60%乙醇60mL洗脫，調(diào)節(jié)流速1.0mL/min，收集洗脫液，按2.2.6項(xiàng)下方法測定二苯乙烯苷含量。計(jì)算洗脫率。結(jié)果見表1。表1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表編號(hào)吸附量/mg吸附率/%洗脫量/mg洗脫率/%1153.388.10 131.986.04 2149.185.69 132.889.07 3146.784.31 1

17、29.388.14 四、結(jié)果與討論大孔吸附樹脂的吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì)，即樹脂的極性(功能基)和空間結(jié)構(gòu)（孔徑、比表面積、孔容），一般非極性物質(zhì)易被非極性樹脂吸附，極性物質(zhì)易被極性樹脂吸附。強(qiáng)極性的大孔吸附樹脂雖然對極性強(qiáng)的化合物吸附能力強(qiáng)，但較難被洗脫，弱極性樹脂吸附能力弱4。大孔吸附樹脂解吸時(shí)受到洗脫劑的種類、濃度、體積、程序、流速的影響。LSA-21樹脂是一種中等極性樹脂，適合分離純化弱極性和中等極性有機(jī)化合物。二苯乙烯苷類化合物多含有酚羥基,可作為良好的氫鍵供體,有利于被極性樹脂吸附。本研究考察了LSA-21型大孔樹脂對何首烏二苯乙烯苷的動(dòng)態(tài)吸附純化工藝,主要從上樣液的濃度、最大上樣量、吸附流速、洗脫劑的含醇量、洗脫流速、洗脫液的用量等方面進(jìn)行考察,從而得到最佳的純化工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明LSA-21型樹脂對二苯乙烯苷類化合物具有較強(qiáng)的富集能力。本實(shí)驗(yàn)研究初步確定LSA-21樹脂對何首烏二苯乙烯苷純化條件為：最大上樣量為1.2g/g(生藥量/干樹脂),藥液濃度為0.2g/mL(相當(dāng)于生藥量)，吸附流速為1.0mL/min，60%乙醇洗脫，洗脫劑用量為60mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明, LSA-21樹脂對何首烏二苯乙烯苷的動(dòng)態(tài)吸附率、解吸率均在80%以上，純化