人苯丙氨酸羥化酶基因克隆及其原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

1、    作者：張志， 黃宗青， 沈琪， 劉洪濤， 鄧英太， 李愛東， 周國強， 汪華僑， 何蘊韶   【摘要】  【目的】 克隆健康人苯丙氨酸羥化酶基因全長cDNA序列，構(gòu)建并鑒定其原核表達質(zhì)粒pTrcHisB/PAH?！痉椒ā?采用RT-PCR方法從人肝組織中擴增 PAH基因全長cDNA，T/A 克隆到pMD18-T載體中，雙酶切后將cDA亞克隆入pTrcHisB載體，構(gòu)建pTrcHisB/PAH質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定并測序?！窘Y(jié)果】 人PAH基因cDNA正確克隆入pTrcHisB表達載體，與Genebank中

2、PAH基因序列一致?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建pTrcHisB/PAH表達質(zhì)粒，為進一步進行研究PAH蛋白表達和重組蛋白活性鑒定奠定基礎。 【關(guān)鍵詞】  苯丙酮尿癥； 苯丙氨酸羥化酶； 克??； 原核表達質(zhì)粒    J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):288-291      苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)是神經(jīng)科常見氨基酸代謝障礙的常染色體隱性遺傳病。98%99%是由于苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）基因突變

3、導致肝臟苯丙氨酸羥化酶活性降低而致病1。當前的基因治療為本病治療提供了嶄新的思路2。國外學者已經(jīng)在PKU小鼠模型上用腺病毒載體轉(zhuǎn)導PAH進行基因治療獲得一定的成功，但是始終未能解決生物安全和如何長期穩(wěn)定表達等問題3,4,阻礙了這種方法的臨床推廣和應用。本研究旨在通過體外原核表達活性PAH蛋白，開發(fā)新型PKU基因治療藥物，改進當前PKU治療單純依靠飲食控制的現(xiàn)狀。我們采用基因工程重組技術(shù)從健康人肝細胞中定向克隆出人PAH基因,構(gòu)建pTrcHisBPAH原核表達質(zhì)粒并進行鑒定，為以后PAH蛋白的體外表達打下基礎，結(jié)果報道如下。    1  

4、0;材料與方法    1.1   材料    1.1.1   主要材料和試劑   新鮮肝臟標本來自中山大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科肝血管瘤病人手術(shù);pTrcHisB、TOP10 (Invitrogen), pMD18-T Vector (TaKaRa),Trizol (GIBCO)、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (#1621)、EcoRI、Kpn I (MBI Fermentas), QIA quick Gel Extraction Kit、

5、QIA Spin Miniprep Kit (QIAGene)、T4?鄄DNA Ligase (Invitrogen)。大腸桿菌DH5為中山大學達安基因中心提供。    1.1.2   主要設備   玻璃勻漿機、高速冷凍離心機、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、80 冰箱（日本SANYO公司）、PE9600 PCR擴增儀、ABI3100 Avant DNA測序儀（美國PE公司）。    1.2   方法    1.2.1  引物設計   GeneB

6、ank上登錄PAH基因mRNA序列(GI：18765884)，在Primer Premier5.0和 Olig6.0軟件設計引物擴增PAH的編碼序列(CDS)，5端設計Kpn 和EcoR 酶切位點加上3個保護堿基。引物由上海生工合成。    1.2.2   目的基因的獲得   從人新鮮肝臟標本Trizol法提取總RNA，檢測A260和A280值，計算濃度，80 保存。取RNA 2 g采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA(complement DNA)。以PAHcDNA為

7、模板做RTPCR。反應條件: 93 10 min、 93 45 s、56 45 s、72 1 min，35個循環(huán)后, 72 10 min。PCR產(chǎn)物濃縮后在0.8%瓊脂糖上電泳（1 377 bp），用QIA quick Gel Extraction Kit割膠純化， 1瓊脂糖電泳鑒定、拍照、20 保存。    1.2.3   PCR產(chǎn)物克隆和鑒定   克隆反應體系:純化的PCR產(chǎn)物4 L、 pMD18-T Vector 1 L、Ligation Solution I 5 L，16 過夜，得到pMD18-T/PAH質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿

8、菌 DH5a，涂含氨芐青霉素LB平板，IPTG進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，體外擴增并PCR初篩后菌液抽提pMD18-T/PAH質(zhì)粒，用Kpn和EcoR雙酶切并測序鑒定。測序正向引物為M-47, 反向為M-48, 中間引物為5-TGGAATACATGGAGGAAGA-3。測序在中山大學達安基因中心完成。    1.2.4   原核表達載體   pTrcHisB/PAH 構(gòu)建和鑒定  質(zhì)粒pTrcHisB空載體和質(zhì)粒pMD18-T/PAH分別經(jīng)Kpn和EcoR雙酶切，割膠回收目的基因片斷和空載體。目的基因與空載體pT

9、rcHisB按51的比例混合進行連接反應, 加入4連接酶2,反應體積為10 ,18 連接過夜。反應液全部轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10細菌中培養(yǎng)過夜，在含氨芐青霉素LB平板上隨機挑取10個單菌落，搖菌培養(yǎng)，PCR初篩后抽提pTrcHisB/PAH質(zhì)粒，用Kpn和EcoR雙酶切并全長測序鑒定，測序引物為RTPCR引物和上述中間引物。    2   結(jié)   果    2.1   肝組織總RNA結(jié)果    提取總RNA電泳后可見三條帶, 說明提取的RNA較完整。所測1、2兩個標本的A260

10、 / A280分別為2和1.99，其濃度分別為4.84和2.85 ?滋g/?滋L，RNA純度符合要求。    2.2   PAH基因CDS序列的RT-PCR結(jié)果    本研究設計RTPCR片段大小為1 377 bp，包含PAH基因的CDS序列1 359 bp。圖1中P為RTPCR產(chǎn)物，片段大小與預期設計基本相符。    2.3   pMD18-T/PAH酶切結(jié)果    RT-PCR的片段大小為1 377 bp,pMD18-T的大小為2 692 bp, PMD-18/PAH大小

11、理論上應為1 377+2 692= 4 069 bp。酶切鑒定結(jié)果(圖2)與設計結(jié)果相符。    2.4   pTrcHis/PAH酶切結(jié)果    pTrcHisB空質(zhì)粒大小為4 400  bp,PAH基因CDS的大小為1 359 bp,理論上pTrcHis-PAH的大小為4 400+1 359=5 759 bp,酶切鑒定結(jié)果(圖3)與設計結(jié)果相符。    2.5   pMD18-T/PAH測序結(jié)果    測序結(jié)果表明pMD18-T/PAH序列與GeneB

12、ank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pMD18-T/PAH5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)Kpn和EcoR限制性內(nèi)切酶的識別序列均完整。    2.6   重組表達質(zhì)粒測序結(jié)果    測序結(jié)果表明pTrcHis-PAH質(zhì)粒序列與GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pTrcHis-PAH質(zhì)粒（圖）5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)KpnI和EcoRI限制性內(nèi)切酶的識別序列均完整, 序列完全正確，未見框移和突變(圖)。 

13、60;  3   討   論    PKU是1934年法國醫(yī)生Folling首次報道。PKU是常染色體隱性遺傳病，其致病基因PAH基因已經(jīng)成功分離、克隆5。PAH基因定位于12號染色體(12q22-12q24.1)，大約由1.5 Mb堿基組成。PAH基因是斷裂基因，mRNA為2.4 kb，編碼區(qū)包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。mRNA大小為1 353 bp，翻譯成含451個氨基酸的酶單體6,7。    PKU是由于PAH基因突變導致PAH酶的催化活性減弱或消失引起1。迄今全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PKU有5

14、24多種不同類型的突變（http:/www.mcgill.ca/pahdb）。1997年后PKU分子遺傳學的研究熱點逐漸轉(zhuǎn)為PAH基因突變的功能研究，即進入PAH后基因組學研究，我國學者也在這個領域做了大量的工作，發(fā)現(xiàn)了很多新的突變8。迄今全世界共發(fā)現(xiàn)70余種致病突變，導致PAH酶的催化功能減弱或消失，引起體內(nèi)苯丙氨酸的蓄積致病 9,10。    我們于2003年采用熒光PCR技術(shù)成功建立經(jīng)典型PKU的基因診斷方法11。鑒于目前國內(nèi)外研究PKU基因治療的報道尚少，為了探討PKU的新型基因治療方法，彌補PKU治療的缺陷，本研究采用基因工程技術(shù)，根據(jù)Genebank中PAHcD

15、NA序列,自行設計一對引物,分別在引物5端和3端設計KpnI和EcoRI酶切識別位點,并添加保護堿基,擴增包括目的基因在內(nèi)的全部序列,PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體構(gòu)建pMD18-T/PAH質(zhì)粒，KpnI和EcoRI雙酶切鑒定后全長測序證實pMD18-T/PAH質(zhì)粒序列完整、正確，即包含起始密碼、終止密碼及兩端的KpnI和EcoRI識別序列。pMD18-T/PAH質(zhì)粒雙酶解消化，目的基因片段定向克隆入pTrcHisB表達載體，藍白斑篩選挑白色菌落，PCR初篩后轉(zhuǎn)化入TOP10菌體中擴增，抽提重組質(zhì)粒，Kpn和EcoR雙酶解鑒定，最后全長測序。測序結(jié)果表明我們獲得的pTrcHisB/PAH質(zhì)

16、粒序列與GeneBank上PAH基因cDNA序列(GI:18765884)一致, 且pTrcHis/PAH質(zhì)粒中5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)KpnI和EcoRI限制性內(nèi)切酶的識別序列均完整, 序列和方向完全正確，未見框移和突變,表達質(zhì)粒的成功構(gòu)建為下一步重組蛋白的表達和純化研究奠定了堅實的基礎。目前,該重組質(zhì)粒的表達及其重組蛋白的活性鑒定研究正在進行之中。【參考文獻】  張 志,何蘊韶.苯丙酮尿癥分子遺傳學研究進展 J. 遺傳, 2004, 26(5): 729-734.DING Z, HARDING C O, THONY B. State-of-t

17、he-art 2003 on PKU gene therapy J.Mol Genet Metab, 2004, 81(1): 1-2.HARDING C O, GILLINGHAM M B, HAMMAN K, et al. Complete correction of hyperphenylalaninemia following liver-directed, recombinant AAV2/8 vector-mediated gene therapy in murine phenylketonuria J. Gene Ther, 2006, 13(5): 457-462.OH H J

18、, LEE H, PARK J W, et al. Reversal of gene expression profile in the phenylketonuria mouse model after adeno associated virus vector mediated gene therapy J. Mol Genet Metab, 2005,86 Suppl 1:S124-32.WOO S L C, LIDSKY A S, GUTTLER F D, et al. Cloned human phenylalanine hydroxylase gene and allows prenatal diagnosis and carried detection of classical phenylketonuria J. Nature, 1983, 306(1):151-155.SCRIVER C R, WATERS P J, SARKISSIAN C, et al. PAHdb: a locus-specific knowledge base J. Hum Mutat, 2000, 15(1): 99-104.SCRIVER C R, HURTUBISE M, KONECK